实验二总糖和还原糖的测定(DNS).doc

实验二 总糖和还原糖的测定 ──3,5－二硝基水杨酸比色法 一、目的要求：  掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法 二、实验原理: 在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量   三、试剂和器材 1、试剂 3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取5.0g DNS溶于200ml 2mol/L NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入到酒石酸甲钠的热溶液中（192g就是酸甲钠溶于500ml水中），再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，摇匀溶解后，冷却定容至1000ml，暗处保存备用葡萄糖标准溶液：准确称取在105℃的温度下烘干至恒重的葡萄糖0.5g，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至1000ml 6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml 碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中0.1% 酚酞指示剂：0.1g酚酞溶于100ml无水乙醇中1％淀粉 2、材料淀粉 3、器材 WFJ UV－2000型分光光度计，水浴锅，电炉，10ml比色管四、操作方法  1、葡萄糖标准曲线制作取6支10ml比色管并编号，按下表顺序加入各种试剂表1）试 管 号0（空白）12345葡萄糖标准液/ml0.00.10.20.30.40.5蒸馏水/ml0.50.40.30.20.10.0DNS试剂/ml0.50.50.50.50.50.5葡萄糖含量/mg0.00.050.100.150.20.25A540混匀后置沸水浴上加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水4.0ml，摇匀，在540nm波长下，用0号管调零，分别读取各管的吸光度值A540以葡萄糖含量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线   2、淀粉水解及还原糖的提取取1％淀粉25ml，放在100ml烧杯中，加入6mol/L HCl 10ml，然后加入蒸馏水15ml，混匀，于沸水浴中保温30min，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I2-KI溶液检查水解是否完全。

如已水解完全，则不呈现蓝色水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，从中取10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于还原糖测定  4、样品中含糖量的测定取3支10ml比色管，分别按下表加入试剂：（表2）项 目空白淀粉水解液067样品溶液/ml00.50.5DNS试剂/ml0.50.50.5蒸馏水/ml0.500 注：0号管同表1中0号管； 6号、7号为淀粉水解液平行实验加完试剂后，于沸水浴中加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水4.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量 5、结果处理 按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量： 式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml； m──样品重量，g；1000──mg换算成g的系数  五、注意事项 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色 思考题1. 比色时为什么要设计空白管？2. 比较费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果，这两种方法各有何优点？。