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多糖成分分析综述 多糖成分分析 摘要：对多糖的提取、分离纯化、含量分析以及组分结构分析的研究进展进行了综述，并对其应用前景进行了展望多糖的组分分析是多糖质量控制和提供多糖基本信息的重要环节 关键词：多糖；提取；分离纯化；表征鉴定 多糖(polysaccharides,PS)又称多聚糖，由10个以上的单糖分子通过苷键聚合而成，其分子量较大，一般由几百甚至几万个单糖分子组成，是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物大分子虽然糖类的研究并不比蛋白质和核酸晚，但其研究层次与水平还远远落后于蛋白质和核酸多糖在自然界高等植物、动物、藻类及细菌类内均有存在，分布极广有些多糖无生物活性，如淀粉、树胶和粘液质等，通常被当做杂质除去而具有药效作用的多糖大多是活性多糖1969年，日本学者千原率先证实了香菇热水提出物的抗肿瘤活性，羽田、佐木进一步研究证实有效成分是香菇多糖自此，全世界掀起了从真菌中提取抗肿瘤活性成分的热潮[1]尤其近年来，随着生物学、化学等相关学科的飞速发展，多糖化合物也得到了日益深入的研究国际科学界视多糖的研究为生命科学的前沿领域，甚至提出21世纪是多糖的世纪 鉴于多糖研究所具有的学术价值和广阔的应用前景，使得多糖研究成为人们关注的研究热点之一；又目前研究比较多的是植物多糖和微生物多糖，因此本文将就植物多糖和微生物多糖的成分分析研究进行概括、总结，并就存在的问题加以展望。

1 多糖的提取 多糖的提取通常要根据多糖的存在形式及提取部位不同决定其提取方法一般从植物中提取多糖，先用石油醚、乙醚、丙酮等有机溶剂进行预处理，除去脂溶性杂质[1]然后根据不同的溶解度选择一种溶剂进行萃取，常用的为水、稀盐、稀酸、稀碱等溶剂传统的提取方法有水提醇沉法、稀碱浸提法、稀酸浸提法和酶法等，随着对多糖研究的不断深入，又出现超滤法、微波辅助浸提法以及超声波法等等 1.1 溶剂提取法 溶剂提取法是提取多糖的常用方法，利用多糖不溶于乙醇的性质在提取液中加入乙醇使多糖沉淀出来常用的粗多糖的提取方法有：水提、酸提和碱提采用碱溶液提多糖时，易使多糖的糖苷键断裂，通常要充氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾加以保护，且这种提取方法只适用于含果胶物质少、粘度小的原料；酸性条件下提取，也会引起多糖 降解及糖苷键的断裂，因此在稀酸提取时，时间宜短温度不宜太高；水提法提取成本低，适用于游离态多糖的提取，且干扰物质少易除去，但要求提取工艺中要控制温度、时间、加水量等[2]张国强[3]等用水提醇沉法提取百合（Bulbus lilii）中的多糖成分，温度60℃，采用10倍体积的蒸馏水，沸水浴提取3h，真空干燥1h，再于105 ℃干燥箱中烘干，即得灰白色的百合多糖粗品；用Sevage法除蛋白质。

黄杰等[4]通过水提法研究了浸提温度、浸提时间、料液比对茶多糖得率、茶多糖含量及蛋白质含量的影响，得出较佳的茶多糖提取工艺，浸提温度宜在55℃，浸提时间宜为3h，料液比达到1:25 即可 1.2 超声波辅助提取法 超声波辅助提取技术是利用超声波产生的振动作用，使媒质质点温度升高，产生空穴效用，加强了胞内物质的释放扩散及溶解，提高了破碎速度，缩短了破碎时间，极大地提高提取效率曲哓兰[5]探讨用超声法提取马齿苋多糖，结果表明最佳提取工艺为60℃加10倍量水超声提取45min，提取2次与传统水提法相比，超声法提取马齿苋多糖，提取率高，节省提取时间 1.3 微波提取法 微波辅助提取技术主要是利用微波加热的特殊性质，细胞内的极性分子吸收微波能后产生撕裂和相互摩擦引起发热，使胞内温度迅速升高，连续高温使其内部压力急剧升高，导致细胞破裂，促进溶剂进入和胞内成分流出，提高提取效率Wang等[6]利用微波辅助法提取鹅绒委陵菜中的多糖，在微波功率523W条件下，提取率达到13.33%，与传统水提法相比不但极大缩短时间、节约能源、提高效率，而且提取的多糖具有更高的活性 1.4 生物酶辅助提取法 酶提法是利用果胶酶、纤维素酶等对细胞结构的破坏作用，使存在于细胞内部的多糖释放出来，从而提高了多糖的得率。

梁敏等[7]利用木瓜蛋白酶提取枸杞多糖，在木瓜蛋白酶添加量为0.3%、酶解反应温度为45℃、pH值为7.0、反应时间为2h条件下，提取率为14.9%，比传统热水提取提高65.6%钱志伟等[8]研究了酶法提取马齿苋多糖的工艺条件，考察酶用量、酶解温度、pH、酶解时间对马齿苋多糖提取得率的影响结果表明：最合适的工艺参数为酶用量2.0%、酶解温度40℃、pH值6.0、酶解时间110 min，该条件下，马齿苋多糖得率可达9.7% 2 多糖的除杂质 2.1 蛋白质的去除 采用醇沉或其它溶剂沉淀得到的粗多糖中常含有较多的蛋白质，需要除蛋白除蛋白的方法传统上有Sevage法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等 Sevage法是根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，将氯仿按多糖水溶液的1/5体积加入，然后用1/5氯仿体积的正丁醇混合后剧烈振摇20~30 min成乳化液，蛋白质变性成胶状，离心后除去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质将Sevage法结合酶法去除蛋白效率可提高68%，且可以节省大量的试剂和时间刘晓红等[8]对金樱子多糖采用Sevage法、木瓜蛋白酶法、Sevage法和木瓜蛋白酶法相结合进行脱蛋白研究，发现两者相结合的效果最佳。

三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)是一种有机酸，可以使多糖中的蛋白质由于有机酸的作用而变性沉淀，TCA法是在多糖水溶液中滴加3%等体积的三氯乙酸，混匀静置过夜，离心除去胶状沉淀，重复以上的操作即得无蛋白质的多糖，且可与正丁醇(V/V=1:10)联合取得理想的脱蛋白效果[9] 2.2 色素的去除 粗多糖中常含有一些色素(游离色素和结合色素)，根据其不同的性质采取不同的除素方法常见的脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、藻土、高岭土、活性炭等)杨利剑等[10]取已去皮、晒干的板栗，粉碎后称取100g，经热水提取，冷却后离心，用20% H2O2脱色，用胰匀浆、Sevage法和三氯醋酸除蛋白多次，直至紫外检测无蛋白质(280 nm左右)和核酸(260 nm左右)及其它杂质对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法以同时除去蛋白和色素，方法是加入菲林试剂、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等与多糖生成不溶性络合物，经分离后用阴离子交换树脂分解络合物得到多糖[11] 3 多糖的分离纯化 3.1 超滤法 超滤法采用中空纤维超滤膜，对多糖去蛋白质后的提取液通过超滤去除小分子杂质。

MarnochR等[12]应用超滤法纯化芥子蛋白张佳[13]用截流分子量为50000的管式陶瓷膜纯化香菇多糖，在超滤温度40℃，跨膜压差0.20 MPa，流速4.5 m/s-1的条件下超滤，蛋白质去除率为81.0%，多糖纯度为89.7%，收率为77.6% 3.2 沉淀法 包括分布沉淀法、盐析法及金属络合法其中，分步沉淀法[14]分级分离是利用不同性质以及不同分子量段的多糖在不同浓度的乙醇中的溶解度是有差别的这一特点，分离沉淀到某一性质或某一分子量段占主要部分的多糖王卫国等[15]向香菇粗多糖溶液中分别加入一定比例的甲醇，3000rpm离心15 min，分离得到L1、L2、L3三个组分季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离陈海华等[16]采用季铵溴化物络合法分离得到酸性多糖(acidic polysaccharose,AFM)和中性多糖(neutral polysaccharose,NFM)粗制品 3.3 柱层析法 包括大孔吸附树脂、凝胶柱层析法、纤维素阴离子交换剂柱层析法、高效液相层析，此外还有大孔树脂层析、亲和层析、活性炭柱层析等。

目前，国内多采用凝胶柱层析和离子交换柱层析法其中，凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，使各种多糖得以分离纯化，但不适宜粘多糖的分离高义霞等[17]将经脱蛋白、脱色后的沙蒿多糖用ultrahydrogel TM500 (7.8mm×300 mm)层析分离纯化，0.1 mol/L磷酸缓冲液洗脱，在凝胶色谱中出现单一而对称的峰，纯化效果好、纯度高离子交换柱层析法[11]常用的交换介质有DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖凝胶(DEAE-Sephadex)、DEAE-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose),此法适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖，最常用的是DEAE-纤维素，它一方面可纯化多糖，另一方面还可分离各种多糖洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等赵宇等[18]将海蒿子多糖粗品溶于少量蒸馏水中，离心，上清液加入DEAE-Sephadex A-25层析柱，NaCl溶液梯度洗脱，收集得到两种均一性多糖 3.4 色谱法 色谱法是利用填料对不同种类的糖吸附作用的差异，使混合物中各糖分达到彼此分离的方法，是常用的纯化多糖的方法，包括离子交换色谱和凝胶色谱。

马莉等[19]将DEAE 纤维素离子交换色谱柱分离得到的板蓝根多糖粉末用Sephadex G75凝胶色谱柱分离纯化，以磷酸缓冲溶液为洗脱流动相，得到4种板蓝根均一多糖：PS1、PS2、PS3、PS4 多糖广泛参与细胞的各种生命活动而产生多种生物学功能，是非常丰富的资源，多糖的提取分离纯化方法在不断更新，在选取方法时，应当关注目标多糖的性质、特点，综合比较进行实验，才能选取最佳的方法和工艺 4 多糖的表征鉴定 4.1 含量测定 确定样品中的糖类含量，给取样溶解打基础国内多用显色剂-硫酸法，根据单糖、多糖及其衍生物在硫酸作用下水解，脱水生成糖醛衍生物，与酚类、芳胺类等缩和成有色化合物，比色定量，间接求出多糖的含量苯酚-硫酸法生成橙黄色溶液，在490 nm 处有强吸收；蒽酮-硫酸法生成亮绿色溶液在620 nm处有强吸收，其蒽酮试剂需新鲜配置咔唑-硫酸法用于测定糖醛酸[20]这些方法简单、快速，无需多糖纯品和高级仪器，因而被广泛应用于多糖的含量测定 4.2 分子量测定[21] 多糖的分子量分布比较分散，所以一般测得的分子量是一种统计平均值过去常用渗透压法、端基法、粘度法、光散射法等，这些方法操作复杂且误差较大。

目前较常用的方法有凝胶过滤法和高效液相色谱法此两种方法须先用已知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量对于分子量小于5万的多糖可采用质谱法 4.3 组分分析 多糖的单糖组成分析是控制多糖质量和提供多糖基本信息的最重要环节 目前，多糖组分分析方法一般来说可以分为：传统的化学分析法、物理分析法（仪器分析法）和生物学分析法其中，化学分析法包括部分酸水解和完全酸水解后中和、过滤，可采用纸层析（PC），薄层层析（TLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱法（HPLC）和离子色谱法进行分析骆传环等[22]红景天中糖组份的分析中，将红景天多糖水解后进行糖的纸色谱分析，据Rf值判断红景天多糖的组份为鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖仪器分析法种类较多，应用广泛，比如分光光度法、红外光谱法、核磁共振法、气相色谱（GC）、质谱法（MS）等张汇等[23]分别采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)和气相色谱法(GC)分析黑灵芝菌盖、菌柄和孢子粉多糖的分子质量分布和单糖组成，结果表明三者都以甘露糖、葡萄。