实验室做细胞常用染色-第4篇.docx

    实验室做细胞常用染色    实验室做细胞常用得细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养得细胞,在进行各种染色前常需先制备成涂片为了保证细胞在长时间得染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附得物质就是经常采用得方法之一.能促进细胞黏附得物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸得涂布方法.1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Dｅcoｎ)浸泡５min，间或振荡2、用自来水冲洗5miｎ3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5miｎ．4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水）浸泡5ｍin,振荡6、入60℃烤箱1ｈ,或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学).二、细胞固定常用方法固定细胞得目得在于把组织与细胞得原有结构尽可能完整地保存下来,避免组织与细胞发生降解、自溶、腐败与变形等,使细胞与组织内得各种酶失去活性，防止细胞与组织得各种分子变性、解离,使细胞得化学物质与酶能准确定位，并在以后得处理与制片过程中亦不发生改变与破坏同时，固定还可使细胞得各部分易于着色,适于观察、长期保存与分析.1、固定组织、细胞得基本原则：尽可能选用新鲜培养物;根据检测工具、对象、目得与要求选择固定剂与固定方法。

2、培养物得准备与固定前处理:各种细胞培养物,如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物与盖片单层培养物都可作固定材料.对双盖片悬滴培养物与悬液培养物来说,常通过离心收集细胞，PBS漂洗2~3次后,备固定制片；对盖片单层培养物来说,将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～３次,以洗去血清与附着于细胞表面得残渣,备固定用.3、常用固定液:常用得固定液分两类，一类就是以单一化学物质配成得固定液,称简单固定液主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸）．另一类就是用两种或两种以上化学物质配合成得固定液，称混合固定液如Muｅlｌer固定液、Flｅｍｍiｎg固液、FAA固定液、 Carnoｙ固定液、Ｒosｓｍan固定液、Aｌｔｍann固定液、Bouing固定液等不同得固定液对细胞得化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同因此,选择合适得固定液就是达到固定目得得基础１)4%甲醛－PＢS:甲醛就是一种气体，其饱与水溶液无色,约含4０%甲醛.在很多情况下,甲醛常常产生多聚甲醛得白色沉淀4％甲醛—PBS使组织变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织得外部形式,固定效果不受制片影响，固定材料可用苏木精与其她合成染料染色。

甲醛得穿透力较强，对组织固定均匀,能增强组织得弹性，大标本得固定与保存多用甲醛甲醛就是染色体、线粒体与高尔基体得固定液,在冷冻切片中,甲醛作固定剂具有显著得优点.用40%甲醛水溶液:PBS=１:9配方制备甲醛固定液2）丙酮:丙酮为无色易挥发液体,用纯冷丙酮(４℃)固定细胞内酶效果较佳.(3)乙醇:乙醇又称酒精,固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌与白细胞等效果优良无水乙醇或乙醇与醋酸得混合液就是固定肝糖原及肌糖原得良好固定液乙醇除有固定作用外，还具有硬化与脱水得作用.作为固定用乙醇得适宜浓度为７0%~1００%乙醇得缺点就是渗透力差,并使组织收缩.（４）醋酸:常用0、３％~５%浓度得醋酸作固定剂.醋酸能与水及乙醇、甲醇溶合,醋酸不固定蛋白质,但能固定核酸醋酸得穿透力很大，它对细胞得膨胀作用显著,这就是由于它破坏了某些蛋白质分子得结合,所以,常用醋酸来减少其她固定剂引起得细胞收缩细胞学技术中,它能防止细胞收缩，并能较好地保存染色体,还能把染色质沉淀成为可染色得块状体.(５）苦味酸:苦味酸就是黄色结晶体，强酸,可溶于水、乙醇、苯与二甲苯,在水中得溶解度可因水温变化而变化苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、组蛋白与核酸。

苦味酸得穿透力很慢，单独使用时，造成组织严重收缩它与其她药物混合配制时,可以作为蛋白质得沉淀剂,同时可避免组织收缩、硬化,而且易于染色.所以在很多混合固定液中被广泛采用作固定用得最适浓度为1%.(6)锇酸(四氧化锇）:锇酸就是一种强氧化剂,不能同乙醇与甲醛混合使用它得挥发性很强,挥发出来得气体能固定结膜,对眼睛很有害，所以操作时应特别注意四氧化锇就是保存细胞结构得最好固定剂之一，配制时先在棕色试剂瓶中盛入５０～10０mｌ０、１mol／L磷酸缓冲液(pH7、0~7、4),再将装有1g 锇酸得安培瓶放人PBS中,以玻棒击碎安培瓶,摇荡使锇酸溶解，备用常用得固定液浓度为1%~2%７)戊二醛：戊二醛对组织得渗透率高,与蛋白质反应快，能较好地保存蛋白质，对微管与膜性结构保存亦比较好，并能较好地保存糖原常用得戊二醛固定液配制方法列于表12-1表12—1 常用得戊二醛固定液配制方法(8）甲醇／醋酸固定液：甲醇:醋酸为3：1得固定液就是应用最广得一种培养细胞固定剂甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，两者结合，能使固定细胞形态不变.不仅最适用于固定染色体,而且固定得染色体适于Gieｍｓa染色(注意:此固定液宜现用现配)。

９)FAA固定液：此固定液适用于固定盖片单层培养得细胞,固定效果好.配制方法:90ml 80%酒精中加5ml冰乙酸与5ｍ１40%甲醛10)Ｃarｎoy固定液:Carｎｏy固定液就是较好得非水溶性固定液，就是显示细胞化学成分(如粘多糖等)时常用得固定剂,固定、保真效果好,但穿透力差，适于固定培养得单层细胞.配制方法：60ml纯酒精加30ｍｌ氯仿与１0ml冰乙酸．(１１）Ｂouin固定液:用于固定双盖片法培养得标本，固定30分钟后，用70％酒精褪去苦味酸黄色，如不立即染色,可将标本保存在７０％酒精中本试剂适于固定组织细胞得糖原配制方法:先将75mｌ饱与苦味酸（100ｍl水中加１、2~１、4ｇ)过滤,加入25ml福尔马林(４0％甲醛,有沉淀时禁用),最后加入5ｍl冰醋酸,混与后存于４℃冰箱中备用冰醋酸最好在临用前加入该固定液对组织细胞穿透力较强,固定效果较好,保存得细胞结构完好.但因偏酸(pＨ为 3~3、5),对抗原有一定损害12）4％多聚甲醛-PBS固定液:多聚甲醛为白色固体,在５0ml蒸馏水中加入4ｇ多聚甲醛,加热至６０~70℃时,边搅拌边逐滴加入2ｍｏl／ＬＮａＯＨ,至液体清晰透明．用１mｏｌ/LHCｌ调节ｐH 至7、４，冷却后加入 0、01ｍｏl/LPBS液至10０ml,4℃保存。

本试剂适于固定肾纤维蛋白与细胞骨架蛋白三、常见得细胞染色方法１普通染色观察苏木精-伊红(hematoxylin—eｏｓin,HＥ)染色与Giｅmsa染色就是观察培养细胞一般形态得最常用方法,也就是把细胞作为标本保存得主要方法．对于贴壁培养得细胞，以生长于盖玻片与塑料培养瓶壁者便于操作固定前先用Haｎｋｓ液、PBS、ＢSS或生理盐水清洗培养物2次,去除妨碍染色得血清固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1０0０r／ｍin，1０miｎ),弃上清液后（留少量液体),将细胞悬液滴于玻片上做成涂片,冷风吹干1、１HＥ染色法1、1、1染液配制（１）苏木精染液:这里介绍鄂征(１995）改良得Maｙer法称取０、5g 苏木精,5、0g铵矾或钾矾,0、1ｇ碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水再加入３0ml甘油, 2ml 冰醋酸过滤后即成母液可长久保存用蒸馏水以１:２０稀释即成工作液，可用很长时间每次染色前宜过滤,去除氧化膜2)伊红染液:伊红有醇溶性与水溶性之分将0、5g伊红溶于１00m1７０％乙醇或蒸馏水即成工作液.１、１、２染色程序（1)用１0％甲醛(福尔马林)固定培养物３0miｎ，或以丙酮固定15miｎ。

2)蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5~１0miｎ染细胞核3)入0、５%盐酸—70％乙醇溶液3０～1min,脱去胞质得着色此时核呈紫红色.(4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色如果时间允许,最好用自来水(呈弱碱性）长时间浸泡也可入１%NaHCO3溶液此过程须不断用显微镜监视，以掌握碱化时间.(５)蒸馏水洗1 ｍiｎ,去除残留得碱性溶液，否则影响伊红着色6）入伊红染液3０s～1 ｍiｎ７）用梯度乙醇溶液脱水:７0％、9０％、95%乙醇各30ｓ~1miｎ；100%（2次)各２ｍin如伊红为乙醇溶液，略去70%乙醇8）用二甲苯透明2次,各5min9)树胶封固１、1、3染色结果细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞得胞质呈粉红色如果胞质内含较多核糖体（例如淋巴细胞)则亦呈蓝色.１、2吉姆萨染色法此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握,效果常不如HE染色稳定1、２、1吉姆萨(Giｅmｓa)染液得配制(1)取1、5g吉姆萨粉末放入5０ml甘油,置于60℃温箱,约3h后溶解２）取出后倒入5０mｌ中性甲醇,即为母液.于棕色瓶可长久保存需要注意得就是,有得甲醇内含醋酸,会使染液中得伊红沉淀出来,不利染色。

3)将母液与０、1 mol/LPBＳ(Ph6、9~7、２)按１:9混合即成工作液吉姆萨染液对pＨ极敏感,偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝所以,工作液宜现用现配,保存时间不超过48h以免被CO2酸化1、２、2染色程序（１)将标本用甲醇固定５~1０min2)入吉姆萨液染色10~１5mｉn可用染色缸；或将染液滴覆于标本.(３）蒸馏水清洗，空气干燥，二甲苯透明,树胶封固.1、2、3染色结果细胞核呈蓝或蓝紫色，胞质呈色与ＨE染色相仿  -全文完-。