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课题5 DNA的粗提取与鉴定【课题】：课题5 DNA的粗提取与鉴定【备课人】：【备课时间】:【上课时间】：【课型】:复习【课时数】：1课时【复习冃标】本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，理 解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理复习重点与难点】复习重点：DNA的粗提取和鉴定方法复习难点：DNA的粗提取和鉴定方法知识冋顾】一、实验原理提取生物大分子的基木思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质 的生物大分子对T DNA的粗捉取而言，就是要利用DNA-与RNA、蛋白质和脂质等在物理 和化学性质方面的差异，提取DNA,去除其他成分1. DNA的溶解性DWA和蛋门质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适 当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离冃的此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精利用这一原理，可 以将DNA与蛋口质进一步的分离2. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对D7A没有影响大多数蛋白质不能忍受60-80oC的高 温，而DNA在80oC以上才会变性。

洗涤剂能够瓦解，但对DNA没有影响3. DNA的鉴定在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺口J以作为鉴定DNA的试剂二、实验设计1. 实验材料的选取凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使丿IJDNA含量相对较髙的生物纽织，成功的 可能性更大2. 破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸谓水，同 时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解 细胞膜例如，捉取洋葱的D7A时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分 的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液注意:%1 为什么加入蒸餾水能使鸡血细胞破裂？蒸饰水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀 裂，再加上搅拌的机械作川，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放 出 DNAo%1 加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是 NaCl,有利于DNA的溶解1 如果研磨不充分，会对实验结果产牛怎样的影响?研糜不充分会使细胞核内的DNA释 放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不 显示蓝色等。

1 此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和R\A等杂质2. 去除滤液中的杂质方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋门酶分解 蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和D7A的变性温度不同注意:①为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质？川高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析 出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质因此，通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与 DNA溶解度不同的多种杂质②方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是 DNA和蛋门质对高温耐受性的不同，从而使蛋门质变性，与DNA分离3. DNA的析出与鉴定将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2〜3min,溶液中 会出现白色丝状物，这就是粗捉取的DNA用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用 滤纸吸取上而的水分取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml,将丝状物放入其 中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺 试剂。

混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色 的变化，看看溶解有DZA的溶液是否变蓝三、实验步骤一以洋葱为实验材料1. 称取30克已切碎的洋葱,放入研钵中,加入少量石英砂助研,倒入lOmL 2mol/L的 氯化钠溶液，充分研磨洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行上课前，教师可先将洋 葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几人块，放入清水泡一会 儿，让具挥发性刺激物溶于水，叮以减轻刺激然后将洋葱切碎备川研磨的目的主耍是 使洋葱细胞破裂，使DM溶于加ol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既 浪费时间又影响实验效果研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）使用搅拌器虽对以提高 研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除只能将酒 精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起來，D7A藏在其中，无法分辨学生 看不到白色纤维状粘稠物的DNAo2. 研磨后，川漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液3. 向滤液中加入95%的酒精溶液20mL,沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有 白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒对将其轻轻卷起。

这就是记录生命遗传信息的重要物质 ——DNAo DMA析出的过程中，切忌震动和搅拌（不震动易于分层，我们就能很容易观察到 上清液中的丝状物；搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段，不易取出）如果用玻璃棒 DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙签，DNA提取物就缠绕在牙签上了4. 鉴定：取两支试管，编为1、2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL,向1号试管中 加入一些白色纤维状物，振荡使具溶解，然后向两支试管中各加入2皿二苯胺试剂，沸水 浴加热5分钟四、注意事项1. 以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固2. 加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地 操作加入酒粘和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DWA分子的断裂，导致DNA分子不 能形成絮状沉淀3. 二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效杲4. DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0. 14mol/L时,随浓度的升高,DNA的溶解度降低;当NaCl溶液 浓度高于0. 14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高5. 盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量木来就 比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，捉取到的DNA就会更少因此，实验过程中最好使 用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失典例解析】木实验中冇三次过滤：⑴过滤川蒸馆水稀释过的鸡血细胞液⑵过滤含粘稠物的0. Mmol/LNaCl溶液⑶过滤溶解有DNA的加ol/LNaCl溶液以上三次过滤分别为了获得（）A含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液B含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液C含核物质的滤液、滤液中D\A粘稠物、纱布上的DNAD含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液【习题巩固】一、选择题（10个）1. 在研究DNA的基因样本前，采集來的血样需要蛋口水解酶处理，然后用有机溶剂除去 蛋门质用蛋门水解酶处理血样的U的是（）A. 除去血浆中的蛋白质B.除去染色体上的蛋白质C.除去血细胞表|Hi的蛋白质D.除去血细胞中的所有的蛋门质，使DNA释放，便于进一•步提纯2. 与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是（）A. 操作时缓缓滴加蒸馆水，降低DNA的溶解度B. 在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整C. 加蒸僻水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出D. 当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度相当于0. 14mol/L3. 洗涤剂能够瓦解（），但对DNA没有影响。

A.细胞壁B.细胞膜C.细胞核D.细胞质4. 在沸水浴的条件下，3遇（）会被染成蓝色A.斐林试剂B.苏丹III染液C.双缩腺试剂D.二苯胺5. 在DMA提取过程中，最好使用型料试管和烧杯，L!的是（）A.不易破碎B.减少捉取过程中DNA的损失C.增加DNA的含量D.容易洗刷6.下列操作 中，对DNA的提取量影响最小的是（）A. 使鸡血细胞在蒸僻水中充分破裂，放出DNA等核物质B. 搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌C. 在“析出DNA粘稠物”时，耍缓缓加蒸憎水，玄至溶液中粘稠物不再增加D. 在川酒精沉淀DNA时，要使川冷酒精，其至再将混介液放入冰箱中冷却E在D\A的溶解和再溶解时，要充分搅拌7. DNA的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的（），静置2—3min,溶液中会出 现白色丝状物A. 0. 9%的NaCl B. 0. 14mol/L的NaCl溶液C.质量分数15%的HC1 D.体积分数为95%的 酒精溶液&以血液为实验材料时，需要向血液中加入（），防止血液凝固A.酷酸钠B.龙胆紫C.柠檬酸钠D.醋酸洋红9. 在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸憎水的口的是（）A.加快溶解DNA的速度B.加快溶解杂质的速度C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出D. 减小杂质的溶解度，加快杂质的析出10. 去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（）分解蛋白 质。

A.胃蛋白酶B.胰蛋白酶C.木瓜蛋白酶D.肠肽酶二、非选择题（3个）1. 提取鸡血中DNA时，要除去血液中的上清液，这是因为什么？2. 填写本实验完成下列实验操作吋所用试剂⑴提取鸡血细胞中核物质⑵溶解核内DNA：⑶析出2mol/LNaCl溶液中的DNA⑷DNA粘稠物的再溶解⑸捉取杂质较少的DXA白色乳状丝状物（6）DNA的鉴定3•关于DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做 实验材料的原因是什么？请冋答下列问题：⑴鸡血细胞中红细胞，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中细胞树木较多，可 以提供丰富的⑵实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主耍原因是⑶生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验耍求完成实验步骤 后，结果是，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中，但若改用动物肝脏做实验 材料，实验能顺利进行这是因为⑷若选用动物肝脏做实验材料，在提取Z前，最好增加程序，使组织细胞更易分离。