复合人工骨修复犬股骨头缺损坏死中再血管化与钙含量的关系【大学临床医学毕业论文设计.doc

临床医学论文•复合人工骨修复犬股骨头缺损坏死中再血管化与钙含量的关系作者：刘钢，彭吾训，邓进，龚跃昆，李世和【摘要】〔冃的〕观察骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、 碱性成纤维细胞生长因了 (basic fibroblast growth factor 5 bFGF)与异体脫 抗原松质骨(allogeneic antigen extracted cancellous bone ? AACB)复合 后修复股骨头坏死(femoral head necrosis，FHN)病灶清除区缺损，评价bFGF 对FHN的再血管化作用及其与钙含量的关系〔方法〕取18只杂种犬共36侧股 骨头，建立液氮冷冻诱导性犬股骨头缺损坏死模型，随机分为A、B、C 3组，每 组12侧A组为空白对照，B组植入AACB/BMP，C组植入AACB/BMP/bFGF每 个股骨头内植入AACB约0.33 g，BMP约12.5 mg，bFGF约2 000 U术后3、6 和12周分批处死动物，每组每次处死2只行组织学观察，免疫组织化学染色， 进行血管计数和血管面积图像分析、钙含量测定、并分析再血管化作舟与钙含量 间的关系。

〔结果〕组织学观察，12周时A组以纤维结缔组织为主，B组多量新 生骨组织形成，密度不均，C组股骨头骨缺损完全修复血管计数和血管面积， C组术后3周移植物孔隙内人量血管增生，6和12周时血管数量和血管面积进一 步增加，各时间点都大于A、B组，具有统计学意义(P<0.05)钙含量，C组 术后3周钙含量小于B组，12周时大于B组(P<0.05)再血管化作用与钙含 量的关系，C组与B组比较，术后3周时再血管化与钙含量呈负相关，12周时呈 正相关〔结论〕AACB是生长因子的良好吸附载体'适宜新生血管长入吸附 有bFGF及BMP的AACB具有较强的再血管化能力，bFGF促进植骨材料吸收，加 速新骨形成这一疗法有望成为FHN治疗的一种手段关键词】股骨头坏死；骨形成蛋白；碱性成纤维细胞生长因子；异体骨股骨头坏死(fcmoTal head necrosis,FHN)为临床上常见的骨科疾病，其 治疗较棘手骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)和碱性成纤维细 胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是近来硏究较多的两种 骨生长因子。

BMP的高效诱导成骨活^[£已经被许多实验和临床硏究证实〔1〕 bFGF能促进BMP诱导成骨，尤其bFGF是一强大的血管生成因子〔2〕为此本 文通过液氮冷冻法建立犬股骨头缺损坏死模型〔3〕，模拟临床上开窗减压植骨 术的治疗过程，以BMP/bFGF/异体脫抗原松质骨(allogeneic antigen extracted cancel lous bone ? AACB)复合人工骨充塡骨腔，以观察bFGF在股骨 头内促进BMP诱导成骨及再血管化过程，以及再血管化与钙含量间的关系，初步 评价其促进早期FHN愈合的可能作用1材料与方法1.1主要试剂及材料CD34单克隆抗体(迈新试剂公司，上海)；AACB/BMP/bFGF复合人工骨由昆明医学院第一临床学院骨科实验室制备〔4〕1.2动物模型的制作及实验方法健康成年杂种犬18只，雌雄不限，体重(12.0±1.9) kg (昆明医学院动物 实验中心提供)3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉，无菌操作下行双侧競外侧切口， 显露股骨头，按龚跃昆等〔5〕的方法制作股骨头缺损坏死模型造模后8周， 将18只犬36侧股骨头随机分为3组，每组6只12侧采用造模时同样的手术 入路，A组为空白对照，刮除坏死的软骨下骨，直到松质骨红润，形成直径约1.5 cm的骨缺损，不植入任何材料:B组植入AACB/BMP :C组植入AACB/BMP/bFGF。

术后3、6和12周分批各处死2只犬取4侧股骨头，进行观察分析1.3观察指标1.3.1大体观察动物处死后，解剖股骨头行剖面大体观察1.3.2组织学观察股骨头以10%甲醛固定'硝酸脫钙'石蜡包埋，切片后HE染色，光镜观察1.3.3免疫组织化学染色、血管计数和血管面积图像分析采用CD34单克隆抗体切片厚4 “m，按常规ABC法进行免疫组织化学染色阳性为棕黄色，定位于血管内皮细胞胞浆，以已知阳性组织切片为阳性对照 在每张切片的用人工骨修复后原缺损区随机选取3个100倍视野行血管计数采 用HPIAS 1 000高清晰度彩色病理图文报告分析系统测定血管面积，血管面积 二血管截面面积/统计场面积X100%1.3.4钙含量测定、血管数和血管面积与钙含量的关系分析采用XL 30扫描电镜能谱分析仪测定缺损区修复后的钙含量用SPSS 11.5 软件分析血管数及血管面积勻钙含量的关系1.4统计学处理用SPSS 11・5统计软件包分析处理所有数据，以均数士标准差表示，采用组 间单因索方差分析和相关性分析，PV0.05为有统计学意义2结果2.1大体观察A组：3和6周缺损清晰可见，12周仍有缺损残存；B组：3周移植物色红润，12周多量新生骨组织形成，密度不均；C组：3周肉芽组织生长活跃，色红 润，大量新骨形成，12周与宿主骨颜色及密度一致，界限不清。

2.2组织学观察A组：3、6和12周缺损区始终以纤维结缔组织为主B组：3周纤维组织长 入移植物孔隙内，6周移植物大部分吸收，12周移植物完全吸收，多量新生骨组 织形成C组：3周肉芽组织生长活跃，移植物6周完全吸收，大量新骨形成， 12周骨改建接近正常，与宿主骨界限不清2.3免疫组织化学•免疫组织化学染色光镜下观察见，A组：术后3、6和12周血管稀疏散在， B组：血管数量少，分布散在，C组：各时间点血管丰富，吻合成网（图1）图1术后6周免疫组织化学显示血管化程度（x 100）（略）n.A组血管稀少;b.B组血管数量少，分布散在;c.C组血管丰富，吻合成网2.4血管计数免疫组织化学染色光镜下进行血管计数，经方差分析，在各时点A组血管数 少于 B 组（PC0.05），A、B 组少于 C 组（P<0.05）（表 1）表1各时点血管计数（略）*与A组比较，P<0.05 ； #与8组比较，P<0.052.5血管面积测定血管面积后经方差分析，在各时点A组血管面积小于B组（PV0.05）， A、B组小于C组（PV0.05）（表 2）表2各时点血管面积比较（略）*与A组比较，P<0.05 ； #与8组比较，P<0.05。

2.6钙含量测定缺损区修复后的钙含量经方差分析在各吋间点A组钙含量小于B组（P <0.05），A、B组小于 C组（PV0.05）（表 3）表3各时点钙含量（略）*与A组比较‘ P<0.05 ； #^B组比较‘ P<0.052.7血管数与钙含量的关系B组与C组比较，3周血管数与钙含量呈负相关（PV0.05） ； 6周血管数与 钙含量呈正相关（P<0.05） ; 12周血管数与钙含量呈正相关（P<0.05）2.8血管面积与钙含量的关系B组与C组比较，3周血管密度与钙含量呈负相关（P<0.05） ;6周血管密 度与钙含量无相关（P〉0・05） ；12周血管密度与钙含量呈正相关（P<0.05）3讨论至今，仍无一种公认满意的疗法用于治疗成人FHN骨生长因子能促进骨形 成和血管再生，因此即有可能成为改善FHN治疗效果的一个突破口〔5〕本文 采用AACB作为BMP和bFGF的载体，按一定比例制成AACB/BMP/bFGF复合人工 骨，并模拟临床开窗减压植骨术治疗FHN的过程，移植修复犬股骨头缺损坏死模 型按龚跃昆等〔3〕的方法制作股骨头缺损坏死，术后3 d即发生股骨头缺损 周围骨坏死，若不植入修复材料，12周仍不能自行愈合（A组，空白对照组）， 表明此造模方法是可行的。

B组修复后12周AACB降解吸收，具有天然松质骨易 于降解吸收的优点，但骨组织密度不均，其成骨效能不足以修复股骨头这一特殊 部位的缺损坏死骨诱导、骨形成是一个由多种生长因子参与并调节的过程〔5〕BMP对分 化成熟的骨和软骨细胞基本无促增殖作用，而bFGF可促进成熟骨和软骨细胞增 殖，刺激其他生长因子分泌，而且是一种作用强的血管生长因子〔6〕实验表 明制备的复合人工骨（C组）的成血管性能明显优于A、B组无论是血管计数 还是血管面积，在所有时相上均明显超过A、B组，且差异有统计学意义（P< 0.05）通过B、C两组血管数和血管密度与钙含量的关系分析表明，3周时血 管数和血管密度与钙含量呈负相关，AACB降解吸收较快；12周时血管数和血管 密度与钙含量呈正相关，表明C组新生血管多，新骨形成多，矿化较彻底bFGF 的再血管化作用促进了移植材料的吸收和新骨形成该实验结果表明人工骨在修复股骨头坏死时显示出明显的再血管化作用，促 进了移植材料的吸收和新骨形成，速度明显快于AACB/BMP组和空白对照组，能 够为以缺血为主要矛盾的FHN的修复提供新思路硏究不足：其安全性未得到进 一步实验，复合人工骨的生长因子剂量、浓度还有待深入探讨。

参考文献】〔1〕Iwata H,Sakano S,Itoh T,et al.Demineralized bone matrix and native bone morphogenetic protein in orthopaedic surgery〔 J〕・C1 in Orthop Relat Res,2002, （395） :99 109.〔2〕李晓辉，龚跃昆，宋跃明，等•碱性成纤维细胞生长因子复合部分脫蛋白骨增强兔股骨头骨缺损修复作用的硏究〔J〕•中国修复重建外科杂志，2005，19 (3) : 183 186.〔3〕龚跃昆，彭吾训，李世和，等•液氮冷冻建立犬股骨头缺血坏死模型 的实验硏究〔J〕•中国矫形外科杂志，2005, 13 ( 15) : 1171 1173.〔4〕彭吾训，龚跃昆，李世和，等.复合型生物衍生组织工程骨的制备及 其理化特性〔J〕・云南医药'2004 » 25 (6) : 458 460・〔5〕Mont MA,Jones LC,Einhorn TA,ct al.Ostconccrosis of the femoral head .Polcnlinl treatment wi th growth and differentiation factor 〔J 〕 . Cl in Orthop Relat Res,1998, (355 Snppl) :314 335.(.6〕Zeng H,Du Jy,Zheng QX,et al ・Effects of basic fibroblast growth factor on biological characteristics of osteoblasts 〔J〕 .Chin J。