原位杂交探针设计原则.docx

原位杂交探针大体可分为三类:寡核苷酸探针，cDNA探针，RNA探针寡 核苷酸探针由25bp左右的核苷酸组成，通常可以由公司合成，由于其序列较 短，因此特异性较强，原位杂交时可以区分家族基因，同一基因的不同剪切 体,cDNA探针长约500bp左右，可以通过非对称PCR扩增合成，由于探针式 DNA，可以有效的避免降解，但DNA和RNA的结合不如RNA与RNA结合 强，通常不采用，RNA探针长约500bp左右，通过体外转录合成，如果设计合 理，其特异性是可以得到保证的，其主要缺点是容易被RNAse酶降解查看原位杂交相关的文献发现，2000年以前的原位杂交常使用放射性标记 的寡核苷酸探针，通过胶片曝光来显色,2000年以后的文献常使用RNA探针 许多肾脏发育的文献虽然有很多原位杂交数据，但却没有附带上探针序列或者 用于探针模板克隆的引物，通过了解厦门黄老师斑马鱼和昆明毛炳宇爪蟾中原 位杂交探针设计方法，我们可以采用RNA探针.文献中很难找到关于RNA探针 设计的原则，有的文献报道直接用cDNA合成RNA探针借鉴爪蟾中原位杂交 探针设计流程，以小鼠FGF10的探针设计为例进行介绍.1.在NCBI数据库中下载该FGF10的mRNA全序列，然后用FGF10的全长在NCBI中进行BLAST比对分析，比对数据库选择mouse genome+transcript, 比对程序选择 somewhatsimilarsequence。

ZebrafishseqRNAsChoose Search SetDatabase oHuman genomic + transcript ©Mouse genomtc 4 transcript OOthers (nr etc.):< P^ouse genomic plus transcript jMcuse G+T) ***Prnnram SelecticnOptimiie for(_) Highly similar sequeiKes (megablastj0 More dissimilar sequences ^discontiguous megablast；® Somev/hat similar sequences [blastn；Choose aBL^STalgorithm得出的比对结果中有一幅图谱，显示比对序列与数据库中序列的相似性，探 针应设计在与其它基因不存在明显相似性的区段，在比对结果的图谱中选择可变区如下图黑色框区域Color key for alignment scores<40 40-50 5Q-S0 80-200 >=200Query | I I I I I I1 900 1000 2700 3600 45002. 估计黑色框碱基在FGF10 mRNA中的大致范围，在这个范围内选择长约500bp的序列设计探针.根据上图信息，我们选择FGF103000〜3800的范围 进行探针设计。

agcacagaggcacaatgctttggtttatgggtataggttgcattt3301tgtggtgttctttcaacttgttttctgacaaatgggatttttaaaatgtatacttcttgt3361ggttggattctgtatgttagagtttaattggtaactgagtctaaaggctctaatgtaatg3421aatctctagaagaactaggtatctttttttacttttattttaaaataataattatacctg 3481acacatgaccatggaccacccacaaccaaaattaaatgtttggggagacaaactatagta3541ttcagtgacaagggtaacagcaaatagtgcagacgttggattcttatttcactttgccat3601ttagattactaaagagactatgtgtaaacagtcatcattatagtactcaagacattaaac3661agcttctagcaaaatgtatcaaagcttgcagagtccaaaaatagaaaacatctttccccc3721tctcccaccctacatttccccctgtatgcatcctaacagagat 底纹标注的为引物序列3. 将设计好的探针序列在UCSC上再次比对分析，genome选择mouse, querytype选择translated RNA,点击submit,保证搜索出的条目只有目标基因， 如果存在其它非目标匹配项（既不是来自FGF基因的序列），则需要重新选 择一段探针序列。

BLAT Search GenomeGenome:Assembly:Query typ已：MoussV July 2007 (NCH37ftnni9)〜RmnEatM RNA，qLiGr^-.GCDrshyperlinkVSort output: Output type:agcdc3301 3561 3421 34-51 3541 3 6Q1 3661 3721tg-tggtgttz ggLLggaLLC aatctctaaaacfiGfitgcccttcaotaaca ttfigtttCCD agcttctagc tctaccacccLaEaccrcaisatttcaacttg LgcaLgLEag aaasctaGct stggaccecc aacjat 己住 c:己 ij CLC.ELgigc.cti aaaatgtatctacatttccDtfztctgzcH agcLuaaLLg StCtt-tCttML匚!BLUMU匚匚AU己 口己aat己 tgtgtcELiceL 己己agctLqca cctgta^gcaggCLCCdLLLaa.tggg'a.tttccaacLgacLctt^eatgttaaacQttac己 gtccLtcattc gaqtccaaa己 tcctaacagattaazatgta cuaadggcLc taaaataata tggggagiGs ttctt己七Etc tigtfl.ctcceL 戈七己gaa己己。

己 gatta.cttcttgt LaacgLaarg attatacctaactLtcccat gC.CELttC.ELfiC tCtLtCCCCCsubmit J I m feeling lucky clearMouse BJLAT ResultsBLAT Search ResultsiCIICCTS QlJERy 5CQRZ 5TiS.T END QjSIZE IDEt^ZITY CMRO 5ZM1TD aLART EKD 5PA2T七圮 1M 三弱or 50S 二 5C-3 S3B 10C.C% 13 ++ 119590-2^4 119590571 539你可以点击browser浏览一下所设计的探针序列是否是FGF10的序列以及 所在位置— r io I 4=1 nYour s：白乌，少-| 匚，”卜口『「1 Eimt se.=ircri YourSeq，UCSC E：5S5d on RuF&Utr UHiPrtit-, G^nESftk, CCDS aridFgfiu y卜RefSeq Genes在选择探针序列时，尽量选择3’端的区域，避开可能的选择性剪切，同时也 要避免mRNA的末端序列，因为可能存在翻译终止序列，影响以后的体外 转录效率。

经过上述分析后，探针序列可以较好的避免家族基因的保守序列, 确保特异性我们可以针对每个基因设计两个探针，后面比较一下哪个探针杂交效果最 好。