TRPV6在人参二醇组皂苷(PDS)减轻LPS休克脑损伤中表达的变化及意义.doc

1TRPV6 在人参二醇组皂苷(PDS)减轻 LPS 休克脑损伤中表达的变化及意义作者：王皓 钟加滕 刘宁 马晋彤 王伟伟 石国英 康劲松 孙连坤 于春艳【摘要】 目的 通过观察人参二醇组皂苷(PDS)对 TRPV6 蛋白的影响，探讨 PDS对 LPS 诱导休克时脑损伤的保护机制方法 将大鼠随机分为对照组、LPS 休克(LPS)组、地塞米松(LPS+Dex)组、PDS 低剂量(LPS+PDSL)组、PDS 中剂量(LPS+PDSM)组及 PDS 大剂量(LPS+PDSH)组大鼠静脉注射 LPS(4 mg/kg)4 h 后，观察各组大鼠生存期，计算生存率，Western Blot 检测大脑皮质中 TRPV6 和Bcl 2 的蛋白表达结果 与对照组相比，LPS 组大鼠生存率降低达 50%，脑皮质中 TRPV6 的蛋白表达水平明显降低，Bcl 2/Bax 蛋白表达的比值降低;而与 LPS组相比，LPS+Dex 组和 LPS+PDS 各组大鼠生存率增加，脑皮质中 TRPV6 的蛋白表达水平明显增高，Bcl 2/Bax 比值也增高 结论 PDS 减轻 LPS 诱导的脑损伤，可能与上调脑皮质中 TRPV6 蛋白有关。

【关键词】 脂多糖(LPS)，人参二醇组皂苷(PDS)，TRPV6，Bcl 2，Bax【Abstract】 Objective To explore the protective effect of panaxadiols (PDS) on brain injury induced by lipopolysaccharides (LPS) and its mechanism. Methods Rats were divided into control, LPS, LPS + dexamethasone (DEX) and LPS + PDS low, middle and high dose groups randomly. Survival rate of rats in every group was calculated. The expressions of TRPV and BCL 2 were detected by Western blot. Results Compared with control group, survival rate of LPS group was decreased, the expression of TRPV6 and BCL 2/BAX protein ratio were decreased. Compared with LPS group, survival rates of LPS+DEX group and LPS+PDS groups were increased，and the expressions of TRPV6 protein and BCL 2/BAX protein ratios were also upregulated in LPS+Dex group and all LPS+PDS groups. Conclusions The effect of PDS against brain injury induced by LPS may be related with upregulating 2TRPV6 protein.【Key words】 Lipopolysaccharides (LPS); Panaxadiols (PDS); TRPV6; BCL 2; BAX内毒素(endotoxin) 存在于革兰阴性细菌(G-)细胞壁外膜中,其主要生物活性成分为脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),在内毒素休克的发病机制中具有十分重要的作用。

已有研究表明，神经细胞内的钙离子与颅脑损伤之间有密切关系〔1〕;钙稳态在细胞凋亡中起重要作用〔2〕钙离子转运蛋白(Ca2+ transport protein，CaT1/TRPV6)1999 年从人的小肠中克隆，属于 TRPV 家族，是细胞膜上调控细胞外钙离子内流的主要钙通道之一〔3〕，TRPV6 的活性与细胞内钙离子浓度有关〔4〕已有研究表明人参二醇组皂苷(PDS)能减轻 LPS 休克脑损伤〔5〕本研究的目的是通过复制 LPS 休克大鼠模型，观察 TRPV6 在 PDS 减轻 LPS 诱导的脑损伤时的作用，进一步探讨 LPS 对中枢神经系统损伤的可能作用机制1 材料与方法1.1 实验动物分组 健康 Wistar 大鼠(由吉林大学白求恩医学院动物室提供)48只，体重(250±10)g，雌雄不限，随机分为 6 组(每组 8 只)：对照组、LPS 休克(LPS)组、地塞米松(LPS+Dex)组、PDS 低剂量(LPS+PDSL)组、PDS 中剂量(LPS+PDSM)组、PDS 高剂量(LPS+PDSH)组实验方法参照文献〔5〕进行1.2 脑皮质蛋白的提取 称取 100 mg 脑皮质，加入 1 ml 组织蛋白提取液，用电动匀浆器冰浴上充分匀浆。

2 000 r/min，4℃离心 20 min，弃沉淀，取上清12 000 r/min，4℃离心 10 min，上清即为总蛋白Bio Rad 法测定蛋白含量1.3 Western 印迹检测 TRPV6、Bcl 2 和 Bax 蛋白的表达 各组取蛋白 25 μg 3与 5×上样缓冲液〔250 mmol/L Tris HCl(pH6.8)，10%SDS，0.5%溴芬蓝，50%甘油，5%β 巯基乙醇〕混合，100℃变性 5 min，进行 SDS PAGE 电泳分离蛋白质，电转移到 PVDF 转移膜上PVDF 膜经漂洗、封闭后各加入稀释度为 1∶200 的兔抗TRPV6、Bcl 2 和 Bax 多克隆抗体，4℃，过夜然后各加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG，稀释度为 1∶500，室温孵育 2 h 经 PBST 洗涤，DAB 显色用凝胶成像系统对各条带的吸光度值进行定量分析1.4 统计学方法 结果以 x±s 表示，采用 SPSS13.0 统计学软件进行分析,各组之间各项检测指标比较采用 t 检验2 结 果2.1 4 h 存活率 观察各组大鼠生存期并计算生存率，LPS 组 4 h 存活率是对照组的 50%(P0.05)，LPS+Dex 组是对照组的 80%(P0.05)。

2.2 PDS 对 LPS 休克脑皮质中 TRPV6 蛋白变化的影响 与对照组相比，LPS组脑皮质中 TRPV6 的蛋白表达水平明显降低，而与 LPS 组相比，LPS+Dex 组和LPS+PDS 组脑皮质中 TRPV6 的蛋白表达水平明显增高，其中 LPS+PDSM 组明显增高，如图 11.对照组;2.LPS 组;3.LPS+DEX 组;4.LPS+PDSL 组;5.LPS+PDSM 组;6.LPS+PDSH 组，下图同图 1 各组大脑皮质 TRPV6 的蛋白表达2.3 PDS 对 LPS 休克脑皮质中 BCL 2,BAX 蛋白表达的影响 Western 印迹结4果显示，与对照组相比，LPS 组脑皮质中 Bcl 2/Bax 的比值下降;与 LPS 组相比，LPS+Dex 组和 LPS+PDS 组脑皮质中，Bcl 2/Bax 的比值升高，其中 LPS+PDS 中剂量组的 Bcl 2/Bax 比值明显增加，如图 2 图 2 各组脑皮质 Bcl 2/Bax 的蛋白表达3 讨 论钙离子(Ca2+)在细胞的生命活动中具有重要作用，所有类型细胞的各种功能均不同程度地被钙离子调控细胞内钙离子浓度处于严格的调节控制之中，以维持细胞的重要生理功能。

但这种巨大的钙离子浓度梯度也使细胞处于一种永恒的危险境地，易于受到许多因素的作用，从而影响钙信号调控作用，导致细胞功能异常，严重时可诱导细胞损伤或凋亡〔6，7〕目前的研究结果表明，细胞内 Ca2+浓度的稳定似乎起着更为重要的作用，不管是升高还是降低，打破这种稳态就可能导致细胞凋亡，而细胞膜钙离子通道对维持细胞内 Ca2+浓度的稳定起着十分重要的作用〔8〕研究发现 Bcl 2 还有调节线粒体的功能，它能抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质,如细胞色素 C(Cyt C)、凋亡诱导因子(AIF)胞浆内质网 Bcl 2 蛋白控制 Ca2+离子流,影响胞内 Ca2+重新分布,人们发现凋亡与 Ca2+流从内质网进入胞质有关,且 Bcl 2 能阻断这种钙流〔9〕;Bax 通过作用于线粒体而诱导细胞凋亡的 Bax 分布于线粒体外膜上,引起线粒体膜通透性改变及 MPT 孔开放,可允许相对低分子量的物质，包括 Ca2+自由通过线粒体膜,引起细胞凋亡〔10〕实验结果发现，与对照组相比，大鼠单独注射 LPS 4 h 后，生存率降低，TRPV6蛋白表达明显降低，这提示，大脑皮质 TRPV6 蛋白表达水平的降低，进而影响胞内钙离子浓度稳态，而且 Bcl 2/Bax 蛋白表达水平的比值明显降低，不能抑制钙5内流，导致细胞凋亡。

与 LPS 组相比，LPS+Dex 组和 LPS+PDS 组 TRPV6 明显升高，而且 Bcl 2/Bax 蛋白表达水平的比值明显增高，有抑制细胞内钙内流的可能，稳定细胞内钙离子浓度，从而抑制凋亡，这些与大鼠生存率增高有关以上结果表明，LPS+PDS 组和 LPS+Dex 组 TRPV6 蛋白的表达均明显高于LPS 组，这可能与 PDS 及地塞米松对内毒素休克脑组织的具有一定的保护作用有关参考文献】1 薛 文,李守缄.创伤性脑损伤后钙超载机制的研究进展〔J〕.临床医药实践杂志 2008;17(5):321 4.2 张 瑜,常 明,韩 威,等.钙激活蛋白酶与蛋白酶体抑制剂诱导细胞凋亡的机制〔J〕.中国老年学杂志，2008;28(1):26 8.3 B dding M，Flockerzi V.Ca2+ Dependence of the Ca2+ selective TRPV6 Channel〔J〕.J Biol Chem，2004;279(35):36546 52.4 Nilius B,Prenen J,Hoenderop JG,et al.Fast and slow inactivation kinetics of the Ca2+ channels ECaC1 and ECaC2 (TRPV5 and 6)：role of the intracellular loop located between transmembrane segment 2 and 3〔J〕.J Biol Chem,2002;277(34):30852 8.5 孙际童,李洪岩,苏 静,等.人参二醇组皂苷(PDS)抑制 NOS 和 p38 减轻 LPS休克脑损伤〔J〕.中国病理生理杂志，2008;24(1):44 6.6 Hoenderop JG，Vennekens R,Muller D,et al.Function and expression of the epithelial Ca2+ channel family：comparison of mammalian ECaC1 and 2〔J〕.J Physiol 2001;537(3):747 61.7 Ghoneum M，Matsuura M，Braga M,et al.Scerevisiae induces apoptosis in human metastatic breast cancer cells by altering intracellular Ca2+ and the ratio of Bax and Bcl 2〔J〕.Int J Oncol，2008;33(3):533 9.68 Vennekens R，Hoenderop JG，Prenen J,et al.Permeation and gating properties of 。