HCN4基因心脏起搏机制与心律失常关系研究进展.doc

1HCN4 基因心脏起搏机制与心律失常关系 研究进展【摘要】 HCN4 基因编码超级化激活阳离子电流（If）通道结构蛋白，具有调节心脏起搏的功能，心脏上注射 HCN4 基因转染的心肌细胞可以起到生物起搏作用HCN4 与各种心律失常关系密切，家族性窦性心动过缓等遗传性心律失常患者 HCN4 基因外显子碱基的缺失或颠换突变导致 HCN4 通道蛋白的改变，引起 If 幅度减少，属于常染色体显性遗传心力衰竭、心肌肥厚、心房颤动等获得性心律失常患者 HCN4 基因的表达上调，可以使 If 增大，导致心律失常发生 【关键词】 HCN4 基因；心律失常；心脏起搏机制HCN4 基因属于超级化激活环核苷酸门控阳离子通道基因家族（HCN），参与编码超极化激活阳离子电流（If）通道结构蛋白，是心脏动作电位的缓慢的舒张期自动去极化激活的一个重要组成部分，参与窦房结细胞自发性舒张期膜去极化过程，具有调控起搏的功能1999 年 Ludweding 等［1］在筛查 cDNA 文库时，通过探针发现 HCN4 基因的 cDNA随后，Seifert 等［2］从人类丘脑 cDNA 文库中使用 PCR技术和重组体质粒构建成功克隆出 HCN4 基因。

2003 年，Seifert 等［3］又通过原位杂交和免疫组织化学分析，发现 HCN4 基因在发育中的胚胎心脏上高表达HCN4 基因突变可能与病态窦房结综合征（sick sinus syndrome;SSS）,心房颤动（atrial fibrillation, Af）的多种心律失常相关现笔者就 HCN4 基因的结构功能、心脏起搏机制及其与多种心律失常发生发展关系的最新进展做一综述1HCN4 基因及其蛋白的结构特点21.1 HCN4 基因的定位与结构HCN4 基因位于人染色体 15q23q24，全长 5065bp,含有 8 个外显子，分子量为129.1kDa［4］HCN4 基因 cDNA 的全长为 6.8Kb，有 1 个序列标签位点（STS）HCN4 基因 3’末端的未翻译区长度为 2.6Kb，具有特征性的限制区域和碱基序列5’末端的转录序列中有相当高的 GC 含量（77%），其周围有一个明显的 GpC 岛，这反映出 HCN4 蛋白 N 端可大量出现脯氨酸和甘氨酸的氨基酸残基Northern 杂交和 PCR 分析表明，HCN4 基因主要在心室及心房表达1.2 HCN4 蛋白的结构HCN4 基因的编码产物 HCN4 蛋白是由 1203 个氨基酸组成，包含 6 个跨膜片段(S1  S6 )，一个孔道区以及一个环核苷酸结合域（CNBD）。

其中 S4 片段有一群带正电荷的氨基酸 ,具有电压感受器作用 ,类似于在去极化激活的电压门控 K+通道中的作用HCN4 通道的激活元件包括 S1,S1S2 的联结子，S2 及 S6 的 C 末端区域［5，6］位于 S5 和 S6 间的一段氨基酸序列部分贯穿细胞膜内 ,是形成亲水性孔道而使离子选择性通过的部分 ,称为孔道区(pore region)或 P 区 ,有大多数K+选择性通道所特有的 GYG 标志序列不过除 GYG 标志之外的氨基酸序列和 K+选择性通道是不一样的 ,是造成对 K+选择性低的原因HCN 通道还表现出与环腺苷酸门控通道的高度同源性 ,即在 C 末端存在一个 120 个氨基酸的 CNBD ,它的作用是调节通道对 cAMP 反应［7］将 CNBD 切除后可模拟 cAMP 效应 ,即 HCN 门控的电压依赖性被移向更正的电压水平 ,其幅度类似于 cAMP 饱和浓度时的最大效应HCN4 基因的转录产物可在大脑、心脏和睾丸中表达32HCN4 基因的功能及其心脏起搏机制2.1 HCN 家族基因产物的功能HCN 通道属于电压门控阳离子通道超家族，HCN 家族的基因产物HCN1、HCN2、HCN3、HCN4，是“特种电流”（funny current,If）通道的分子组成元件；If 是心脏起搏电流，并间接起到调控心率自发递质活动的作用。

尽管 HCN4 个家族成员大约 60%基因序列相同，但他们的生物学功能各不相同［8-10］：HCN 通道在神经细胞和心肌细胞中均被发现HCN 基因家族的 4 个成员在心脏中存在的有 3 个 ,即 HCN1、HCN2 和 HCN4HCN2 主要作用在于维持起搏节律的稳定HCN4 主要作用是使起搏的频率维持在一定水平以上并随着机体不同的生理状态而对频率进行调整有研究发现在兔窦房结的某些单个细胞有 HCN1 基因的表达 ,证实心肌细胞上存在 HCN 通道蛋白HCN1 和 HCN2 及 HCN4 分别组装形成的异源多聚体 ,这可能提供一个具有稍快起搏电流的中心细胞 ,这些细胞将具有比周围细胞稍快的搏动频率 ,这是真正心脏起搏点的重要特征HCN3 主要分布于神经纤维上 ,在心房肌组织上则以 HCN2 和 HCN4 亚型表达为主，在窦房结细胞中 HCN4 是最主要的 HCN 亚型Ishii 、Stieber 等［3，11］对部分心肌组织中 2 种亚型对起搏通道的贡献的比较,认为起搏通道由单独的 HCN2 或 HCN4 亚型组成 ,即起搏通道的同源构成学说 ,但也有报道起搏通道由 HCN2 和HCN4 共同组成 ,为起搏通道的异源构成学说。

Notomi 、Shigemoto 等［12］也在实验中发现，在大脑，HCN 家族的 4 中亚型均被检测到，但是各个不同的 HCN 亚型通道的 mRNAs 的表达水平和分布情况却截然不同HCN2 是最丰富的神经通道，在大脑中可以普遍找到与此对照的是，HCN1 和 HCN4 在特定的区域表达量4高：HCN4 主要在丘脑表达，HCN1 主要在海马表达HCN3 在大脑的大部分地方的表达量低，但是在嗅球和下丘脑的一些核团表达量较高HCN 通道也在肾脏和外周神经元，例如脊神经根等处表达基因敲除显示：HCN2 的缺失可以出现窦性心律失常和癫痫［13］，HCN1 的缺失可以出现运动神经学习和记忆的障碍［14］，HCN4 的突变已经在病人中发现表现为自发性窦房结功能失常［15，16］2.2 HCN4 的心脏起搏机制HCN4 在窦房结细胞的舒张期去极化中起到重要作用HCN4 阳离子通道是六个跨膜超级家族之一［6，17］通过对人胚胎肾 293（HEK293）细胞的研究，HCN4 在HEK293 细胞比心肌细胞的激活阈值更低与其他电压门控通道相比，HCN4 通道在超级化时开放，在正电位时关闭HCN4 的平均激活曲线的半最大电压为-72.5mv，环核苷酸 cAMP 和 cGMP 通过使通道的激活曲线向更高的正电位转移11mv 从而提高 HCN4 通道的活动性。

If 最为人所知的作用是通过在窦房结的产生的起搏电流控制心脏的心率和节律［18］If 在紧随动作电位终止的细胞膜超级化时激活，并产生一个使细胞膜缓慢去极化的内向 Na+电流此时，窦房结细胞交感神经刺激将升高 cAMP 的水平和增加 If，从而加速舒张期去极化和心率相反，毒蕈碱样乙酰胆碱受体兴奋降低 cAMP 的水平和减少 If，使心率减缓在窦房结，HCN4 通道的激活产生一个内向的阳离子电流 If，他可以重复的使起搏点电位从70mv 向-40mv 去极化，最终导致动作电位的发生王泽文等［19］的实验结果表明，HCN4 基因修饰大鼠间充质干细胞心脏起搏样细胞具有窦房结细胞类似的动作电位Steiber 等［3］的实验研究结果表明，HCN4+/-的小鼠是能存活的，能够正常喂养，与正常的小鼠无区别但是，HCN4-/-的小鼠胚胎在胚胎期的 9.5 天时死5亡可见，心脏 HCN4 基因的特定缺失会造成与普遍缺失一样的胚胎致死率HCN4 基因缺失的胚胎比正常的胚胎心率慢，同时心脏上没有产生动作电位的成熟的起搏点，心率和动作电位不能通过 cAMP 水平升高而增加Steiber 等［3］推断 HCN4 基因在新生儿窦房结中对起搏电位的产生起着至关重要的作用。

Qu J 等［20］以腺病毒为载体将鼠 HCN4（mHCN4）直接注射入狗左心耳根部，同时右心房缝一参考电极，3-4 天后，迷走神经刺激抑制窦性节律，显示左心房部位有异位起搏点产生，增加刺激亦可抑制该起搏点，对离子通道进一步研究发现，在没有表达 HCN4 基因的细胞 If 为 7±4PA(电压-130mv 时)，而表达有 mHCN4 基因的心房肌细胞起搏电流增大 500 倍以上，在电压-125mv 时电流达 3823±713PA，阈值约为-75mv，平均最大半激活电压为-95.2±0.4mv，而膜电容在两组没区别在另一个实验中,研究小组通过导管将 mHCN2 注入狗的左前分支上，在注射点形成较快的逸搏心率,提示在哺乳动物心肌细胞转染编码起搏电流的 HCN 基因可以形成有效的生物起搏［21］这些研究均提示 HCN4 基因具有特征性的表达模式和缓慢门控作用，参与控制心脏起搏细胞的节律性活动3 HCN4 基因与心律失常发生的相关性3.1HCN4 与遗传性心律失常在 HCN4 与各种心律失常的关系中，研究的最早、最多的当属其与遗传性心律失常发生发展的关系Ueda 等［16］分析了 6 名窦房结功能障碍患者，3 名进展性心脏传导阻滞患者和 14 名自发性的心室颤动患者的 HCN4 基因，发现这些患者 6个已知的离子通道出现阴性突变。

同时，Ueda 等通过对一名 43 岁病态窦房结综合症的女性患者研究，鉴定出 HCN4 基因第 5 个外显子的一个 GA 转换的杂合6现象，导致了核跨膜区域和环核苷酸连接区域的联结部位的一个保守残基asp553asn（D553N）的替换这名患者的姐姐和儿子也患有同种疾病，而在他们的 HCN4 基因也发现突变的杂合现象，但是在对照组 380 组染色体中未发现的突变体外分析提示因为一个显性负相型的 HCN4 通道运输障碍，出现膜表达下降和 If 减低该实验研究结果表明转染的 COS7 细胞中突变通道的共表达通过显性负相方式减少细胞表面正常通道，同时膜片钳检测证实伴有 If 幅度的减低Milanesi 等［22］发现窦性心动过缓与 HCN4 离子通道的编码基因突变相关窦房结的起搏通道自动产生电流和间接调控 cAMP 依赖的心率自动调节与心动过缓相关的突变发生在靠近 cAMP 结合处的部位，功能分析表明突变的通道正常回应 cAMP，与正常的通道相比在一个更负的电位激活这些变化类似模仿轻微的迷走神经刺激，通过减少内向的舒张期电流而减慢心率因此，减少起搏通道的作用而导致家族性心动过缓Milanesi 等筛查了 52 名心脏起搏点 HCN4 基因编码区突变的窦性心动过缓患者。

他们鉴定出一个患有无症状性窦性心动过缓的意大利家庭（心率 43 次/分），携带一个 HCN4 基因第 7 个外显子 ser672 到 arg (S672R)的错意突变，而这个突变是由于第 2016 个核苷酸 CA 的颠换所引起然后，他们对这个家族所有 27 名成员的 DNA 进行检查，PCRSSCP 分析表明所有心动过缓表型中有 S672R 突变的共分离，这个结果提示该突变为常染色体显性遗传出现基因突变的家族成员的心率范围为 43 次/分至 60 次/分，而正常基因的家族成员的心律范围为 64 次/分至 81 次/分，同时计算出 HCN4 基因与窦性心动过缓的最大优势对数评分为 5.47 Nof 等［23］对一个有 8 名患有无症状的窦性心动过缓的患者的四世同堂的家庭的鉴定中检测出一个 HCN4 基因第 4 个外显子的1439GC 的杂合现象，碱基的颠换导致跨膜核成型区域 gly480arg(G480R)保守7残基替换这个突变在 8 个未受影响的家族成员和 100 个不相关的对照基因中未发现基因功能分析表明突变通道的电压激活比正常通道低；基因表达分析表明与正常通道相比，突变通道出现合成和运输的障碍。

SchulzeBahr 等［15］。