Eag1钾离子通道在宫颈癌中的表达以及缺氧对其的调控.doc

1Eag1 钾离子通道在宫颈癌中的表达以及 缺氧对其的调控作者：林爽，李力,刘媛,李书林【摘要】 目的 研究不同病变宫颈组织中 Eag1 表达情况以及缺氧对宫颈癌 Hela 细胞膜上 Eag1 钾离子通道表达和活性的影响方法 采用免疫组化法检测不同宫颈组织和宫颈癌 Hela 细胞中 Eag1 蛋白的表达情况;采用 RT-PCR 法检测不同缺氧时间和缺氧浓度对 Hela 细胞中 Eag1 mRNA 表达的影响采用全细胞膜片钳记录的方法，研究缺氧对 Eag1 钾离子通道活性的影响结果 宫颈上皮内瘤变组织中Eag1 蛋白的表达明显高于正常组，宫颈癌组织中 Eag1 的表达明显高于宫颈上皮内瘤变组;Eag1 的表达随临床分期的增加逐渐增高，Eag1 的表达与病理分级无明显相关性正常培养的宫颈癌 Hela 细胞中即有 Eag1 表达;其表达随缺氧程度加深及缺氧时间的延长明显增强Hela 细胞中 Eag1 钾离子通道是电压依赖性的，具有延迟整流及不失活特性;轻度缺氧条件能使 Hela Eag1 钾离子通道电流强度增大、激活时间缩短结论 Eag1 钾离子通道蛋白有可能成为新的早期筛查和判断宫颈癌生物学行为的诊断指标。

【关键词】 宫颈癌;钾离子通道;Eag1[Abstract] Objective Immunohistochemistry was employed to detect the expression of Eag1 protein in different cervix uteri tissues and CACX Hela cells.Methods We determined the effect of different hypoxia time and hypoxic concentration on the expression of Eag1 mRNA in Hela cell using RT-PCR. Meanwhile, whole cellular patch clamp recording was employed to investigate the effect of hypoxia on activity of Eag1 K+ channel.Results The expression of Eag1 protein in cervical intraepithelial neoplasia (CIN) tissue was significantly higher than that in normal control, and the expression in CACX tissue was remarkably higher than that in CIN group. The 2expression of Eag1 ascended as the development of clinical stage of cervical cancer, but almost irrelevant to pathological grade. Results of immunofluorescence and RT- PCR suggested that the expression of Eag1 significantly increased along with the aggravation of hypoxic degree and prolong of hypoxia time. Whole cellular patch clamp recording showed that slight anoxia condition could augment cell membrane potential of Hela, increase the current intensity of Eag1 K+ channel and shorten the activation time.Conclusion Eag1 K+ channel protein is possible to become diadynamic criteria for new early screening and CACX biological behavioral judgment. Meanwhile, Eag1 played an important role in hypoxic reception of CACX Hela cell.[Key words] cervical cancer; potassium channels; Eag1宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，虽然目前诊疗技术有了较大的提高，但仍有 30%～40%的患者死于局部复发和远处转移。

研究表明组织缺氧是导致肿瘤发生、发展，最终产生放、化疗抵抗的主要原因之一最近有关离子通道与低氧适应之间的关系引起了越来越多的注意[1]目前认为离子通道中最常与细胞增殖和肿瘤相关的是钾通道;其中膜 Eag1 钾离子通道被认为与宫颈癌的相关性最为密切[2]本研究以不同病变宫颈组织为研究对象，通过免疫组化方法研究 Eag1 钾离子通道在宫颈癌发生、发展过程中的表达情况;以体外培养的人宫颈癌 Hela 细胞为研究对象，观察缺氧对 Eag1 钾离子通道表达及电生理活性的影响，以期为宫颈癌的诊治提供新的途径1 资料与方法1.1 一般资料 标本全部来自第三军医大学第三附属医院妇产科 1995 年 12 月-2008 年 12 月诊治的病例，全部标本均经我院病理科诊断并证实，患者年龄24～77 岁，平均 46 岁1.2 细胞准备31.2.1 细胞培养 Hela 细胞为本室培养的细胞株使用含 10%小牛血清的DMEM 培养基，置于 5%CO2、95%空气、37℃、饱和湿度的孵箱内培养1.2.2 缺氧模型 观察细胞 70%～90%融合，在无菌条件下弃去大部分培养液将混合气体(含 90%N2、5%CO2、5%O2)以 10L/min 流量充入密闭容器，持续20min，同时关闭进气口和出气口，抽取气体经血气分析仪检测容器内 O2 浓度小于 5%。

1.3 Eag1 表达的检测1.3.1 免疫组化检测方法 兔抗人 Eag1 单克隆抗体购自 sigma 公司组织标本常规石蜡包埋，制成 4μm 厚切片，常规脱蜡，30%新鲜双氧水灭活内源酶，将切片浸入 0.01M 枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉加热至沸后断电,间隔 10min 重复两次,冷却后 0.02M PBS 洗涤,抗原修复液修复抗原,山羊血清封闭后不洗,滴加 1:150稀释的 Eag1 单克隆抗体,4℃过夜,0.02M PBS 洗后加生物素标记羊抗兔二抗,30℃染色 20min 后,DAB 显色,苏木素轻度复染,二甲苯透明,封片显微镜下观察并计数阳性染色细胞数1.3.2 判断标准 Eag1 主要定位于胞浆和(或)胞膜根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度，对 Eag1 表达做半定量评定[3]按阳性细胞率评分：阳性细胞数占11%为 1 分; 11%～50%为 2 分; 51%～80%为 3 分;80%为 4 分按显色程度评分:染色弱为 1 分;中等染色为 2 分;强染色为 3 分然后将两种评分结合起来分为 4 级:无论染色强度如何,细胞阳性率≤10%为阴性;评 2 或 3 分者为弱阳性(+);评 4 或 5 分为中度阳性(++);6 或 7 分为强阳性(+++)。

若 1 例标本有 2 个染色结果,则4取 1 个纳入统计1.4 RT-PCR 法检测低氧对 Eag1 mRNA 表达的影响 Trizon 试剂盒购自Invitrogen 公司，反转录试剂盒购自 TaKaRa 公司Eag1 引物为：5'-TAATGGCTTCCCTCTTTCATCTCCT-3';5'-TGTTGAGACTCCTCCATTCCTTCCA-3'(450 bp);β-actin 引物为：5'-CACGGCTGCTTCCAGCTCCT-'3';5'-CTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3'(150 bp)取(0.5～1)×107 细胞，按 Tripil 试剂盒说明提取总 RNA，按反转录试剂盒说明进行逆转录反应，Eag1 mRNA 的 PCR 反应条件为 94℃变性 30s，58℃Eag1 退火30s，72℃ 2min，最后 72℃延伸 2min琼脂糖电泳测定 Eag1 mRNA 表达，拍照每组检测 6 瓶细胞1.5 全细胞膜片钳法检测 Hela 细胞缺氧后钾离子通道改变 应用电极拉制器用两步法拉制玻璃毛细管电极应用 Axon 公司的 pClamp 软件中的 Clampex 采集数据，采样频率为 10kHz，滤波频率为 1～5kHz。

PClamp 软件输出刺激命令给膜片钳放大器，通过探头、记录电极施加到细胞内，用于钳制细胞膜电位和诱发钾离子通道电流1.6 统计学处理 应用 SPSS13.0 统计软件对结果进行处理，组间比较采用 χ2检验，Fisher 确切概率法计算 P 值，膜片钳实验获得的全部数据均用 pClampB 9.0(Axon Ins，USA)软件进行分析处理，计量资料采用 t 检验和方差分析，P0.05 为差异有显著性，P0.01 表示为差异有非常显著性2 结果2.1 Eag1 蛋白在不同宫颈病变中的表达52.1.1 Eag1 在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变及宫颈鳞癌中的表达 Eag1 在 3种组织中均为细胞质、胞膜表达，细胞核未见表达Eag1 在慢性宫颈炎及宫颈上皮内瘤变中呈轻度着色，Eag1 在宫颈鳞癌中呈中强度着色，阳性信号弥漫分布于癌巢内(图 1、2、3)Eag1 在宫颈鳞癌中的表达率明显高于慢性宫颈炎组和宫颈上皮内瘤样变组，宫颈上皮内瘤样组内 Eag1 表达率明显高于慢性宫颈炎组，差异有显著性(P0.01)结果见表 12.1.2 Eag1 在各级宫颈上皮内瘤样变中的表达 由表 2 可见，Eag1 在 CIN 各级之中的表达随病变程度的增高逐渐增高，但各组比较差异无显著性(P0.05)。

图 1 Eag1 蛋白在慢性宫颈炎2.1.3 Eag1 表达与宫颈癌临床病理学指标的关系 Eag1 在不同病理分级中的阳性表达率虽然随病变恶性程度的增高逐渐增高，但各组比较差异无显著性(P0.05)在不同的临床分期中，Ⅰ+Ⅱ组 Eag1 表达明显高于 0 期(P0.01)，而Ⅲ+Ⅳ期组 Eag1 表达明显高于Ⅰ+Ⅱ组和 0 组(P0.01)，差异有显著性结果见表 3表 3 Eag1 表达与宫颈癌临床分期、病理分级的关系注:①G 1 and G2;② G2 and G3;③ G 1 and G3;④ 0 andⅠ+Ⅱ;⑤Ⅰ+Ⅱand Ⅲ+Ⅳ;⑥Ⅲ+ⅣI and Ⅰ+Ⅱ2.2 缺氧对 Eag1 mRNA 表达的影响 采用 RT-PCR 法检测了 Eag1 mRNA 在不同缺氧条件下宫颈癌 Hela 细胞系的表达情况，给予不同缺氧条件，3h 后 Hela细胞中其 mRNA 的表达水平不尽相同，随缺氧程度的增加呈现先增高后降低的趋势(图 4);在 5%O2 氧浓度条件下，其表达随缺氧时间的增加逐渐增高(图 5)Eag1 mRNA 水平变化2.3 在全细胞膜片钳方式下分电流钳和电压钳两种模6式分别记录的正常和缺氧后 Hela 细胞膜钾离子电压、电流特性2.3.1 缺氧对膜 K+通道电流幅值的影响 采用电压钳制方式分别给 3 组细胞施以保持电压(holding potential，HP)，对细胞进行去极化电压钳制，测试电压(test potential，TP)范围为-100～+60 mV，HP=-60 mV 时，脉冲阶梯步长为 20mV，刺激频率为 0.2Hz。

缺氧组引出 15 例跨膜 K+电流图，随着测试电压的增大，K+电流幅值也增加，具有电压依赖性。