低温胁迫下水稻基因组DNA甲基化的MSAP分析.docx

低温胁迫下水稻基因组DNA甲基化的MSAP分析 王亚男 范思静摘要 [目的]研究低温胁迫对水稻幼苗DNA甲基化水平及模式变化[方法]以水稻幼苗为材料，利用66个不同的引物组合对来自对照（CK）、4 ℃低温胁迫1 d（T1）、4 ℃低温胁迫2 d（T2）、4 ℃低温胁迫3 d（T3）和恢复2 d（T4）的水稻DNA样品进行甲基化敏感扩增多态性（MSAP）分析，探讨低温胁迫和恢复后，DNA的甲基化水平及模式变化[结果]甲基化水平分析表明，CK、T1、T2、T3处理样本中总甲基化率分别为37.19%、33.79%、33.67%和32.67%进一步分析表明低温胁迫处理导致水稻DNA总甲基化水平降低，然而恢复处理组（T4）减缓了这种趋势[结论]水稻基因组部分位点的甲基化可能参与了水稻对低温胁迫的响应关键词 低温胁迫；水稻；甲基化敏感扩增多态性；DNA甲基化S511 A 0517-6611（2017）04-0135-03MSAP Analysis of Genomic DNA Methylation in Oryza sativa under Low Temperature StressWANG Ya-nan ， FAN Si-jing（Anhui Jinpeiyin Technology Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 230088）Abstract [Objective]Effects of low temperature stress on genomic DNA methylation levels and patterns in Oryza sativa were studied.[Method]In this study， rice seedlings were used as materials to carry out MSAP analysis by using 66 different primer combinations. The experiment included a control group and four treatment groups. T1-T3 were under 4 ℃ for 1-3 days， T4 was the two-days recovery group after low temperature stress. [Result]The methylation levels of CK， T1， T2， T3 treatment were 37.19%， 33.79%， 33.67% and 32.67%， respectively. Further analysis showed that the level of global DNA methylation in O.sativa were decreased under low temperature stress， while normal temperature recovery treatment could alleviate the trend. [Conclusion]Methylation in some loci of rice genome may participate in response of rice to low temperature stress.Key words Low temperature stress；Oryza sativa；MSAP；DNA methylation低溫引起的冷应力是较常见的环境压力之一，它是影响植物生长和发育的一个主要因素。

按照低温程度和植物受害情况可分为冷害（零上低温对植物的伤害）和冻害（零下低温对植物的伤害）两大类[1]为了应对环境变化，将植物事先暴露于低温环境中，使其获得对寒冷的耐受性，这涉及细胞代谢、组织结构的重塑、基因表达的重新编程DNA甲基化是生物界中普遍存在的DNA共价修饰方式大量研究表明，DNA甲基化直接参与植物对干旱、重金属、低温等逆境胁迫的响应，调控基因的表达，从而导致植物表型发生变化[2-4]DNA甲基化已被假设为植物表型临时变化的潜在机制之一目前，研究植物基因组中的DNA甲基化方法主要有甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术、亚硫酸盐测序法、焦磷酸测序法和高分辨率熔解曲线法甲基化敏感扩增多态性技术是采用限制性内切酶Hpa II和Msp I识别DNA序列中的5′-CCGG位点进行酶切，然后对酶切产物进行接头的连接，再对PCR反应进行后续扩增片段多态性分析由于其操作简单、重复性高，已广泛应用于多种植物DNA甲基化的研究[5-9]水稻是喜温作物，在其整个生长历程中，尤其是幼苗阶段，由于季节原因，经常遭遇低温冷害低温胁迫给水稻生产造成巨大的损失，导致稻种萌发率低，幼苗生长迟缓，甚至死亡该研究以中籼两系杂交稻品种两优9526幼苗为材料，利用甲基化敏感扩增多态性技术研究低温胁迫及恢复过程中两优9526幼苗DNA甲基化水平以及模式的变化，为深入了解水稻对低温胁迫的响应机制提供理论参考。

1 材料与方法1.1 材料与处理方法试验以中籼两系杂交稻品种两优9526为材料筛选饱满的种子进行发芽，然后盆栽，待水稻出苗后，进行正常培养，光照100 μmol/（m2s），光周期14 h/10 h（L/D），温度（282）℃待幼苗第4片叶长出，倒三叶完全伸展时，取生长一致的幼苗进行后续试验以正常处理为对照（CK）；4 ℃低温处理1 d为T1处理；4 ℃低温连续处理2 d为T2处理；4 ℃低温连续处理3 d为T3处理；4 ℃低温连续处理3 d后，恢复2 d为T4处理，每个处理设3次重复，取叶片用液氮冷冻，–80 ℃冰箱保存备用1.2 基因组DNA的提取水稻叶片总DNA提取参照改良CTAB法[9]，DNA纯度采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，同时利用NanoDrop ND-2000超微量分光光度计测定230、260 nm处的OD值，将纯度较高的DNA放置在冰箱中保存，以备后续的酶切与PCR扩增试验1.3 DNA甲基化多态性分析采用双酶切组合EcoR Ⅰ/Msp Ⅰ和EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ对DNA进行酶切，具体试验操作参照Xiong等[10]的方法酶切后的DNA采用接头进行连接，然后进行PCR扩增反应，连接的接头与PCR扩增引物在表1中列出。

扩增产物经变性后采用6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳结束后的显影参照Sanguinetti法[11]采用银染显色2 结果与分析2.1 低温胁迫对两优9526幼苗DNA甲基化水平的影响从图1可看出，经酶切、PCR反应扩增后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，共检测出3个甲基化类型，Ⅰ型为无甲基化或单链内甲基化，电泳结果为都有带；Ⅱ型为单链外甲基化，Hpa Ⅱ酶切位点有带，Msp Ⅰ酶切位点无带；Ⅲ型为双链内甲基化，Hpa Ⅱ酶切位点无带，Msp Ⅰ酶切位点有带为了检测水稻幼苗在响应低温胁迫及恢复过程中的DNA甲基化水平变化，利用66个不同的引物组合（表1）对来自对照（CK）、低温胁迫1 d（T1）、低温胁迫2 d（T2）、低温胁迫3 d（T3）和恢复2 d（T4）处理组的水稻幼苗DNA样品进行MSAP分析CK、T1、T2、T3、T4处理组DNA甲基化图谱中总扩增位点数分别为1 835、1 808、1 806、1 812和1 830（表2）從低温胁迫处理前后甲基化率 [（Ⅱ + Ⅲ）/（Ⅰ + Ⅱ + Ⅲ）100%]和全甲基化率[Ⅲ/ （Ⅰ+ Ⅱ + Ⅲ） 100%]的变化来看，低温处理导致水稻幼苗DNA总甲基化水平、全甲基化水平降低；而恢复处理组（T4）减缓了这种趋势，DNA总甲基化、全甲基化水平均有所回升。

2.2 低温胁迫过程中两优9526幼苗DNA甲基化模式的变化经低温处理后，水稻幼苗DNA甲基化的变化主要分为3类，共包括13种带型，其中A类带型（A1～A3）是表示单态性的甲基化位点，即对照与处理间的甲基化位点一致、无变化；B类带型（B1～B5）是指发生去甲基化的位点，与对照相比，经低温处理后，原先甲基化的位点发生了去甲基化，甲基化位点数有所减少；C类带型（C1～C5）是指未甲基化或单链外甲基化的位点发生了超甲基化，即与对照相比，原先甲基化或单链外甲基化的位点经低温处理后发生了超甲基化，甲基化的总位点数有所增加从表3可以看出，与对照相比，随着低温胁迫时间的增加，水稻幼苗基因组中发生DNA甲基化的位点数逐渐降低，而恢复处理改变了这种趋势由此可见，低温胁迫主要诱导植株发生较高比例的去甲基化进一步分析低温造成的DNA甲基化多态性位点发现，产生的超甲基化（C3、C4、C5型）带型是主要的多态性带型（图2），分别占总甲基化位点数的7.33%、7.69%、7.40%3 讨论DNA甲基化是植物正常生长发育所必需的，甲基化水平不足或过高，都会导致植物生长发育不正常和形态结构异常[12]研究表明，非生物胁迫（热胁迫、重金属胁迫、盐胁迫等）对DNA的甲基化水平会造成影响[13-15]。

Kovarik等[15]的研究表明，盐和渗透胁迫可诱导烟草悬浮细胞的异染色质区发生超甲基化，而恢复正常条件后，发生超甲基化的位点又会去甲基化，可见，基因组的甲基化、超甲基化可能是植物适应非生物胁迫机制的内在反应该试验中，在低温处理后，利用MSAP分析方法检测发生甲基化和超甲基化的位点，说明DNA甲基化反应可能参与了水稻对低温胁迫的响应参考文献[1] CHINNUSAMY V，ZHU J，ZHU J K.Cold stress regulation of gene expression in plants[J].Trends in plant science，2007，12（10）：444-451.[2] 黄韫宇，张海军，邢燕霞，等.NaCl胁迫对黄瓜种子萌发的影响及DNA甲基化的MSAP分析[J].中国农业科学，2013，46（8）：1646-1656.[3] 王鹤潼，何蕾，宋杰，等.改进MSAP-PCR技术应用于Cd胁迫下拟南芥DNA甲基化分析[J].农业环境科学学报，2015，34（8）：1618-1624.[4] 杨震，彭选明，张逸妍，等.植物DNA甲基化及胁迫诱导的变异[J].生物工程学报，2016，32（12）：1642-1653.[5] 何克勤，程晓紊，胡能兵，等.甜叶菊种质离体保存后的DNA甲基化研究[J].中药材，2016（10）：2190-2193.[6] 赵云雷，叶武威，王俊娟，等.DNA甲基化与植物抗逆性研究进展[J].西北植物学报，2009，29（7）：1479-1489.[7] 潘雅姣，傅彬英，王迪，等.水稻干旱胁迫诱导DNA甲基化时空变化特征分析[J].中国农业科学，2009，42（9）：3009-3018.[8] 陆许可，王德龙，阴祖军，等.NaCl和Na2CO3对不同棉花基因组的DNA甲基化影响[J].中国农业科学，2014，47（16）：3132-3142.[9] 朱红菊，刘文革，赵胜杰，等.NaCl胁迫下二倍体和同源四倍体西瓜幼苗DNA甲基化差异分析[J].中国农业科学，2014，47（20）：4045-4055.[10] XIONG L Z，XU C G， SAGHAIMAROOF M A，et al.Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines，detected by a methylation-sensitive amplification polymorphism technique[J].Mol Gen Genet，1999，261（3。