【最新word论文】水溶性阳离子荧光共轭聚合物作为荧光探针测定三磷酸腺苷【临床医学专业论文】.doc

1水溶性阳离子荧光共轭聚合物作为荧光探针测定三磷酸腺苷作者：王运王伟何治柯 关洪亮【摘要】 利用荧光光谱研究了三磷酸腺苷(ATP)与水溶性阳离子荧光共轭聚合物的相互作用，发现加入 ATP后，聚合物的荧光强度被显著猝灭，且猝灭程度与 ATP的加入量成正比，据此建立了测定 ATP的方法荧光光谱的激发波长选择395 nm，发射波长为 521 nm，激发狭缝宽度为 10.0 nm，发射狭缝宽度为 10.0 nm在 0.05 mol/L TrisHCl 缓冲溶液(pH=7.4)中，测定 ATP的线性范围为8.0×10-8～1.0×10-5 mol/L; 检出限为 2.0×10-8 mol/L; 回收率在93.6%～105.6%之间; 相对标准偏差在 2.2%～6.9%之间本方法用于三磷酸腺苷二钠药片和鲫鱼肉中 ATP的测定，获得满意结果 【关键词】 荧光共轭聚合物;荧光光谱;三磷酸腺苷二钠1 引 言三磷酸腺苷(ATP)是生物体中重要的能量物质[1]，建立快速、简便监测 ATP的方法对于深入研究其功能具有重要意义目前，测定 ATP含量的方法主要有电化学分析法[2]、生物发光法[3]、高效液相色谱法[4]、毛细管区带电泳法[5]及荧光光谱法[6]等。

但电化学分析法、生物发光法、毛细管区带电泳法和高效液相色谱法存在仪器昂贵、操作繁琐等缺点，而 ATP检测试剂盒价格较高， 试剂保存条件苛刻，不利于反复使用虽然检测 ATP的方法在不断改进，但灵敏度和选择性仍然难以满足实际需要荧光光谱法具有操作简便、灵敏度高、选择性好等特点，作为荧光探针的有小分子[7]、聚合物[8]及量子点等[9]水溶性荧光共轭聚合物作为一类新型荧光探针具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点，还具有“分子导线”的功能，能够实现荧光信号的放大，常用于生物大分子和生物小分子的检测等[10～13]本实验采用的水溶性阳离子荧光共轭聚合物(WCFP)属于一种聚噻吩衍生物噻吩是五元环结构，符合休克尔规则，具有适中的能隙、较宽的光谱响应、良好的环境稳定性和热稳定性，是一类性能优异的 π 电子系共轭光、电材料[14,15]利用 WCFP与 ATP相互作用的荧光光谱特性，建立了以 WCFP为荧光探针测定 ATP的新方法，并将本方法应用于三磷酸腺苷二钠药片和鲫鱼肉中 ATP的测定，结果令人满意本方法不仅简便、准确，试剂稳定、重现性好，而且具有反应时间短，试剂用量少，污染小等优点2 实验部分2.1 仪器与试剂2LS55 型荧光光谱仪(美国 Perkin Elmer公司)，Nicolet Evolution 300型紫外 可见分光光度计(美国热电公司)。

本实验所采用的 WCFP属于一种聚噻吩衍生物，结构见图 1插图单体的相对分子量为 285.57，按文献[16]方法合成ATP(相对分子量为 605.2，上海伯奥生物科技有限公司);WCFP 和 ATP均配制成 2.00 × 10-5mol/L的储备液，其中 WCFP浓度以单位计;其它试剂均为分析纯，所用纯水来自 Aquapro纯水系统(中国重庆颐洋有限公司，18 MΩ·cm)0.5 mol/L TrisHCl 缓冲液2.2 实验方法荧光光谱的激发波长为 395 nm，发射波长为 521 nm，激发和发射光谱宽度带为 10.0 nm实验考察了缓冲溶液、pH 值、离子强度、干扰离子等对 ATP猝灭聚合物荧光光谱的影响3 结果与讨论3.1 ATP 对 WCFP荧光光谱的影响由加入 ATP前后 WCFP的荧光光谱(图 1)可见，WCFP 的最大发射波长均为521 nm(曲线 a)随着 ATP浓度的增加，WCFP 的荧光强度逐步下降(曲线 b～i)，但其最大发射波长并未发生改变3.2 缓冲溶液和酸度的影响考察不同缓冲溶液对体系的影响，发现磷酸盐缓冲溶液对聚合物荧光猝灭较强，影响检测灵敏度;TrisHCl 缓冲溶液较好。

当 TrisHCl 缓冲溶液浓度从0.01 mol/L增大到 0.10 mol/L时，荧光猝灭程度逐渐增强;当 TrisHCl 浓度达到 0.04 mol/L时，相对荧光猝灭程度变化趋于平缓因此，选择 0.05 mol/L TrisHCl 缓冲溶液图 2为不同 pH条件下 ATP对 WCFP荧光的影响在 pH 6～9 之间，加入 ATP前后荧光强度较为稳定，并且在此 pH区间体系被猝灭程度最大由于此实验是研究生理条件下水溶性阳离子荧光聚合物与 ATP的相互作用，因此选用反应的最适 TrisHCl 缓冲溶液(pH 7.4)3.3 工作曲线及检出限WCFP浓度对 ATP测定有一定的影响，当 WCFP浓度过大时，会导致检测灵敏度变低;而 WCFP浓度过小又会影响测定线性范围本实验选择最佳浓度为4.0×10-6 mol/L(按单体计)将不同量 ATP加入到阳离子荧光聚合物溶液中，在最佳实验条件分别测定其荧光强度猝灭值 ΔF，得到工作曲线，其相应的线性回归方程和相关系数分别为 Y=0.81x+10.2，r=0.98，n=5平行测定 12次空白溶液的荧光强度，计算其标准偏差，以 3倍的标准偏差除以标准工作曲线的斜率的方法得检出限为 2.0×10-8 mol/L。

33.4 干扰物质的测定混合体系中阳离子荧光聚合物浓度为 4.0 μmol/L，ATP 浓度为 0.4 μmol/L，考察了共存物质的干扰情况结果表明，以相对荧光强度变化为±5%计，共存组分允许存在的浓度见表 11000 倍的谷氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、乙醇、蔗糖、葡萄糖、NH4Cl、NaNO3、KF、NaBr;600 倍的异亮氨酸、甲硫氨酸、NaH2PO4、乙酸钠; 500倍的 Na2CO3; 300倍的Na2HPO4、K2SO4; 100倍的苯丙氨酸、Na3PO4、NaI; 25倍的有柠檬酸钠、ZnNO3、MgCl2; 12倍的 La(NO3)3、Al(NO3)3, 测定干扰在 5%以内小牛胸腺DNA、牛血清白蛋白(BSA)和腺嘌啉的干扰严重3.5 样品中 ATP含量的测定取 2片三磷酸腺苷二钠药片(每片含量 20 mg)，加入三氯乙酸 0.30 g，过滤，用超纯水定容至 100 mL，再逐级稀释至测定 ATP的线性范围之内新鲜鲫鱼购于当地市场，去除鱼鳞、鱼皮和鱼刺，用表 1 干扰物质的测定 error (%)LAlanine5.0×10-4-3.5NH4Cl5.0×10-4+3.9LGlutamine5.0×10-4-1.7NaNO35.0×10-4+1.1LMethionine2.5×10-4-3.1CH3COONa2.5×10-4+2.5LLeucine5.0×10-4-2.4KF5.0×10-4-1.5LTryptophane4.0×10-4-3.8NaBr4.0×10-4-3.0LThreonine5.0×10-4-1.5NaI4.0×10-5-4.6LIsoleucine2.5×10-4-4.3Na2CO32.0×10-4-4.2LHistidine5.0×10-4+2.5K2SO41.5×10-4-4.5Phenylalanine5.0×10-5-4.0MgCl21.5×10-5+2.0CH3CH2OH5.0×10-4+1.5Zn(NO3)21.0×10-5+4.5C12H22O112.0×10-4+3.9La(NO3)35.0×10-6+3.5C6H12O65.0×10-4+1.9Al(NO3)35.0×10-6+3.8NaH2PO42.5×10-4-2.6Trisodium citrate1.0 ×10-5-4.5Na2HPO41.25×10-4-2.5牛血清白蛋白 BSA1.0×10-7-1.5Na3PO45.0×10-5-2.0腺嘌呤 Adenine2.0×10-8-2.5小牛胸腺 DNA4.8×10-8-2.2 高速组织捣碎机捣碎。

根据文献[17]处理方法提取 ATP，准确称取 1.0 g已捣碎鲜鱼肉样品，加 10倍体积(15 mL)的 4 mol/L HClO4，漩涡混匀器混匀 1 min，冰浴 1 min，重复 7次后，以 6000 r/min离心 30 min，取上清液 2.0 mL，加入 1.8 mL 4 mol/L KOH中和，再以 3500 r/min离心 5 min，取所得混合溶液稀释到测定 ATP的线性范围之内以上测定均以 0.05 mol/L TrisHCl(pH=7.4) 控制溶液的 pH值，ATP 固体标样均在样品制备处理前加入测定结果见表 2， 取得满意的回收率表 2 药片及鱼肉中 ATP含量的测定3.6 作用机理探讨由于 WCFP带有大量的正电荷，常用于 DNA快速高灵敏检测，其原理主要基于其与 DNA之间的静电相互作用[18]为了探讨 WCFP与 ATP的作用机理，考察了离子强度对反应体系的影响(见图 3)如图 3所示，固定 ATP与 WCFP浓度不变，在反应体系中不断增加 NaCl的浓度，可以看出，荧光强度比值图 3 离子强度对体系荧光强度的影响Fig.3 Effect of NaCl on the fluorescence intensity of WCFP and 4WCFPATP at 0.05 mol/L pH=7.4 TrisHCl buffer. The concentration of ATP and WCFP were 4.0×10-7 and 4.0×10-6 mol/L, respectively.(F0/F)随着溶液中离子强度的增加而减小。

这说明水溶性阳离子荧光聚合物与 ATP的相互作用受离子强度的影响较大，静电引力是其相互作用的主要作用力，这与文献[19]报道的 WCFP与 DNA的作用主要表现为静电作用是相吻合的参考文献】1 Sazani P L, Larralde R, Szostak J W. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126(27): 8370～83712 Goyal R N, Oyama M, Singh S P. Electroanalysis, 2007, 19(5): 575～5813 LUO JinPing(罗金平 ), TIAN Qing(田 青), YUE WeiWei(岳伟伟), HE BaoShan( 何保山), CAI XinXia(蔡新霞). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2009, 37(2): 306～3104 Coolen E J C M, Arts I C W, Swennen E L R, Stuart M A C, Dagnelie P C. J. Chromatogr. B, 2008, 864(2): 43～515 CI Wei(慈 薇), CHAI YiFeng(柴逸峰), LIU LiLi(刘荔荔), YIN Cha(尹 茶), WU YuTian(吴玉田). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2001, 29(10): 1144～11466 MIAO YanHong(苗延虹), HOU FaJu(侯法菊). J. Instrumental Anal.(分析测试学报), 2008, 27(10): 1110～11137 Miao Y, Liu J, Hou F, Jiang C. J. Lumin.， 2006, 116(1): 67～728 Li C, Numata M, Takeuchi M, Shinkai S. Angew. Chem.， 2005, 117(39)： 6529～65329 Callan J F, Mulrooney R C, Kamila S. J. Fluoresc.， 2008, 18(6): 1157～116110 Yu M, Liu L, Hu S W。