卫矛抗炎物质基础及其质量控制研究.docx

卫矛抗炎物质基础及其质量控制研究目的：中药卫矛,拉丁学名为Euonymusalatus(Thunb.)Sieb.,系卫矛科(Celastracea)卫矛属(EuonymusL.)具翅状物的枝条或翅状附属物,为落叶灌木又称鬼箭羽,早在几千年前就出现在中国历史的长河中,始载于《神农本草经》,列为中品,其气微,味微苦涩,性寒,无毒,主破血、通经、杀虫,现代临床应用频繁,并且使用范围广泛现代药理学已经对其进行了深入研究,发现其具有调节免疫系统的功能,同时也具备抗过敏,降血糖,降血脂等功能,可以用于治疗多种常见疾病,包括糖尿病、高血脂症、慢性肾病及类风湿性关节炎等主要富含三萜类、生物碱、甾体类、强心苷类、黄酮类、酚酸类及微量元素等文献调研发现,目前中药卫矛在临床上除了作为妇科常用药之外,还常用于治疗其他与炎症相关的疾病,然而对该植物抗炎活性方面的研究仍旧存在较多不足,缺乏系统的抗炎活性物质基础研究；与此同时,卫矛药材并未收录至《中国药典》,缺乏统一质控标准和质量检测方法,而市场上卫矛产品来源多元化、质量参差不齐,难以保障卫矛临床用药的稳定性和有效性因此,本论文的目的旨在系统开展中药卫矛抗炎物质基础、质量控制方法等相关的药学基础研究,为明确中药卫矛的抗炎物质基础、保障药材质量稳定可控奠定基础,也为中药卫矛的二次开发提供理论支持。

方法：1、卫矛抗炎活性部位筛选将卫矛药材用75%乙醇溶液加热回流浸提,浸提液进行减压浓缩到无醇味,得到的卫矛总样,依次予以不同极性溶剂萃取,包括石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇三种试剂,相同体积(V/V=1：1)萃取3次,获得3个极性部位萃取液(分别为石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位)采用MTM检测卫矛3个部位粗提物及乙醇浸膏总提物作用于RAW264.7E噬细胞24小时对其生长的影响，筛选各部位安全浓度范围；选用LPS（1Ng/mL）刺激RAW264.7E噬细胞产生的细胞炎症模型作为受试对象，采用Griess法检测卫矛不同部位（安全浓度范围内选取3-4个浓度）作用于RAW264.在噬细胞24小时后,对其释放NO量造成的影响2、卫矛抗炎有效部位的化学成分研究针对筛选得到的抗炎活性较强的乙酸乙酯部位和石油醚部位分别进行硅胶柱色谱分离,依次予以不同比例三氯甲烷、甲醇溶剂系统按梯度洗脱,对各洗脱部位的化学成分进行系统的研究,通过硅胶柱,大孔树脂,ODS,SephadexLH-20,TLC制备薄层等色谱技术进行分离,利用现代光谱学技术（ESI-MS、1H-NMR13C-NMR.2D-NMR®行化合物结构鉴定.3、卫矛化合物抗炎活性评价基于上述相同受试细胞和细胞模型，采用MTT法检测卫矛化合物作用于RAW264.7B噬细胞24小时对其生长的影响，筛选安全浓度范围。

Griess法检测LPS（1^g/mL）和卫矛化合物（安全浓度范围内）共同作用于RAW264.7E噬细胞24小时对其分泌NO的影响4、基于UHPLC-LTQ-OrbitrapMSnfe术的卫矛化学成分的快速识别与鉴定采用黄酮类代表化合物（槲皮素、柚皮素、香橙素、橙皮苷、山奈酚、金丝桃苷、去氢双儿茶精A、儿茶素、表儿茶素）以及酚酸类化合物（绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸）直接持续进样方式，进样速度为3叱L/min质谱全扫描范围为m/z150-1500,高分辨全扫描分辨率设为30000（以m/z400的半峰宽计）,MS2-MS3采用Orbitrap高分辨扫描，扫描分辨率设为15000,MS4以后的子离子则全部采用LTQ打拿极（dynote）检测选择上一级最高峰进行下级碎裂扫描,碎裂方式为碰撞诱导解离（CID）方式,其碰撞能量为35%,选择峰宽范围为m/z±1以特征离子信号和多级质谱数据为基础,辅以高分辨质谱数据并结合文献证实,推测代表性卫矛黄酮类及酚酸化合物在负离子模式下可能的裂解规律建立卫矛化学成分质谱数据库,并运用UHPLC-LTQ-OrbitrapMSn技术，结合模式成分的质谱裂解规律,对卫矛药材化学成分进行分析。

色谱柱采用ThermoHypersilGoldC18column(2.1mmx100mm,2.7(im),流动相由乙月青(A)和含0.1%甲酸水(B)两相组成，梯度洗脱，液相条件为：5%A(0min);15%A(6min),15%A(12min);38%A(25min);70%A(30min)和90%A(35min);90%A(40min),流速为300仙L/min,DADft测200-400nm范围光谱质谱条件为：选用电喷雾离子源(ESI)与液相部分连接,采用负离子检测模式采集,扫描范围为m/z150-1500,离子源所用气体为氮气,毛细管温度为300,喷雾电压为3.8kV,毛细管电压-18kV一级全扫描采用高分辨设置，其分辨率设置为30000,二级质谱高分辨全扫描分辨率设为15000,三级质谱高分辨全扫描设置为7500多级扫描采用数据依赖性扫描(data-dependentMSnscanning),选取上一级最高丰度母离子进行碎裂并进行动态排除设置(dynamicsexclusion)5、基于UHPLC-ESI-MS/M技术的卫矛11种抗炎活性成分的含量测定运用TSuantumUltra三重四级杆质谱电喷雾(ESI)离子源技术建立快速测定卫矛11种代表性成分阿魏酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素、柚皮素、香橙素、橙皮苷、山奈酚、金丝桃甘、去氢双儿茶精A含量的方法，并对40批不同产地、不同来源的中药卫矛饮片进行检测。

采用ThermofisherAccelaUHPLC超高压色谱系统系统程序为：液相色谱柱为WatersUHPLCBEHC18ft(2.1mmX50mm,1.7Nm)流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水系统组成,分析时间10min,梯度洗脱液相条件为：5%A(0min),25%A(3.5min),90%A(7.5min),95%A(8.5min)和95%A(10min),每次进样前以初速流动相平衡4min流速为300L/min,柱温为室温进样量为5^L,DAD佥测记录200-400nm光谱数据质谱方法采用ESI离子源定量检测采用多反应离子检测(MRM模式，进行正负离子同时检测,离子源所用气体为氮气,辅助气65psi,雾化气60psi其离子对选择如下：阿魏酸：m/z169—125;香草酸：m/z167—152;绿原酸：m/z353—191;咖啡酸：m/z179—135;柳皮素：m/z301-151;柚皮素：m/z273—153;香橙素：m/z287—259;橙皮甘：m/z609—301;山奈酚：m/z285-185;金丝桃甘：m/z463—300;去氢双儿茶精A:m/z675—2716、基于UHPLC-ESI-MS/MS术的卫矛11种抗炎活性成分的大鼠灌胃卫矛提取药液后血药浓度监测SD雄性大鼠SPF级动物房室温环境下适应性饲养一周。

实验组及空白组均按0.8mL/100g剂量分别灌胃给予卫矛提取液或生理盐水并于给药后5、10、15、20、30、45、60、120、240、480、720min大鼠眼眶静脉丛取血750^L至1.5mLEP管内所得血样于3h内经4℃低速离心(5000rpm,10min),取上层血浆,-80℃保存色谱柱采用WatersUHPLCBEHC18(2.1mmx100mm,1.7Nm)流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水系统组成,梯度洗脱系统程序为：8%A(0min)、30%A(3.5min)、85%A(7.5min)、90%A(8.5min)、90%A(10min)流速为300叱L/min柱温为室温进样量为5仙L质谱方法采用ESI离子源定量检测米用多反应离子检测(MRM模式，进行正负离子同时检测，其离子对选择如下：阿魏酸：m/z169—125;香草酸：m/z167—152;绿原酸：m/z353-191;咖啡酸：m/z179—135;柳皮素：m/z301-151;柚皮素：m/z273—153;香橙素：m/z287—259;橙皮甘：m/z609—301;山奈酚：m/z285—185;金丝桃昔：m/z463—300;去氢双儿茶精A:m/z675—271。

内标选择氯雷他定：m/z383-267结果：1、卫矛乙醇提取物具有一定的抗炎活性,其中石油醚部位为浸膏产率最高部位,而三个不同极性部位均展现出强于总提部位的抗炎活性2、筛选得到的卫矛分离纯化得到23个化合物,鉴定了21个化合物结构,其中化合物1,2-bis(4-hydfoxy-3-methoxyphenyl)-1,3-propanediol、lyciumin、3-oxo-21B-H-hop-22(29)-ene、kaempferol-7-methylether、dihydrokaempferol-7-methylether、三棕榈酸甘油酯均是首次从卫矛植物中分离得到3、卫矛化合物1、3、5、6、7、8、9、12、15、17能抑制RAW264.7B噬细胞分泌NO其中化合物豆番烷-3-酮和kaempferol-7-methylether活性最强，在浓度为10仙g/mL时就表现可以比拟甚至超于阳性药物地塞米松对于NO勺释放抑制率影响4、运用LTQ-Orbitrap高分辨多级质谱技术系统研究了卫矛8个主要黄酮类成分和4个酚酸类成分的质谱裂解规律对其关键的离子碎裂位置进行了分析与模拟,首次全面分析了橙皮苷、山奈酚、香橙素、柳皮素、金丝桃甘、柚皮素、儿茶素、去氢双儿茶精A、阿魏酸、香草酸,绿原酸和咖啡酸在质谱中的裂解行为,为研究卫矛相关黄酮类及酚酸类衍生物的定性检测提供依据。

建立了基于卫矛及相关药材的化学成分质谱数据库并运用UHPLC-LTQ-OrbitrapMSn技术,结合模式成分的质谱裂解规律,对卫矛药材化学成分进行分析,共鉴定或推测60个成分,阐明了中药卫矛的化学物质基础为今后的化学成分研究、指纹图谱及质量控制和物质基础研究奠定基础5、 运用液相质谱联用技术快速测定卫矛11种抗炎活性代表成分阿魏酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素、柚皮素、香橙素、橙皮苷、山奈酚,金丝桃苷和去氢双儿茶精含量测定方法,11种活性成分的线性关系良好（R2>0.9993）,检测限和定量限分别小于0.13ng/mL和0.67ng/mL,日内日间精密度分别小于3.85%和3.89%平均回收率范围在97.66%-104.87%,48h内的稳定性良好并运用于40批不同产地的中药卫矛饮片的检测,结果表明该方法用于定量方法开发具有快速灵敏的优点,可用于卫矛及其相关制品的质量控制；研究结果同时表明40批卫矛药材采收自各地的含量测定结果表明：卫矛药材中11种被测成分的总含量变化为0Ng/g-631.04Ng/g,表明不同产地的卫矛药材含量显著不同在40批卫矛药材中,采购于北京同仁堂和产地江西的卫矛药材比之其他产地药材11种代表化合物含量均较高，推测质量相对较好，且归为一类（田类）；河北、湖北、云南、浙江产地的卫矛药材,几乎检测不到绿原酸成分,且黄酮类成分总含量也较少（I类）。

同时柚皮素（平均含量136.68,ug/g）是卫矛药材11种待测成分中含量最高的成分6、采用液质联用技术对大鼠灌胃卫矛提取液后抗炎活性代表成分的血药浓度进行了初步监测采用MRMK式建立了11种指标成分的体内定量检测方法，血浆中香草酸、咖啡酸、阿魏酸、山奈酚、槲皮素、绿原酸、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮素、去氢双。