保健品中16种氨基酸的液质联用法测定.docx

保健品中 16种氨基酸的液质联用法测定【摘 要】目的：建立保健品中16 种氨基酸含量的测定方法方 法:采用高效液相色谱串联质谱法，色谱安捷伦poroshell 120 EC-C18 (50mmX4.6mm,2.7um),以0.35g乙酸铵加水0.5L溶解，然后加 入0.5L乙腈，混合，用乙酸调pH=3.5为流动相，流速0.25ml/min 结果：16 种氨基酸的浓度与峰面积线性关系良好，平均回收率在 78%〜103%之间，RSDW5%结论：高效液相色谱串联质谱法快速、灵 敏、稳定，可用于保健品中氨基酸的含量测定关键词】16种氨基酸；含量测定；液质联用法 氨基酸是氨基和羧基的一类有机化合物的通称生物功能大分子 蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质是 含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物无色晶体，熔点极 高，一般在200°C以上不同的氨基酸其味不同，有的无味，有的味 甜，有的味苦各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀 酸或稀碱中，但不能溶于有机溶剂近年来，随着技术的发展，检测氨基酸的种类及含量的方法很多， 目前测定氨基酸的方法主要有氨基酸分析仪法［1］、高效液相色谱法［2］、毛细管电泳法［3］及液相色谱-质谱联用法［4］等。

本文主要是通 过高效液相串联质谱法来对16种氨基酸的含量进行测定，方法简单， 快速，不用柱前衍生，节省试剂和成本，为保健品中氨基酸的含量测 定提供了新方法1 实验部分1.1仪器和试剂16种氨基酸的混合标准品，（包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、 胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯 丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丝氨酸）安捷伦；乙腈 （色谱纯）CNW；乙酸铵（色谱纯）；乙酸（色谱纯）超声波清洗器（EQ-500）； DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上 海鸿都电子科技有限公司）；BPZ-6090LC型真空干燥箱（上海一恒科 学仪器有限公司）；高效液相色谱仪（安捷伦 1260）；色谱柱：安捷 伦 poroshell 120 EC-C18 柱（4.6mmX50mm, 2.7um）；质谱（API3200） 美国AB公司1.2色谱条件流动相:称取0.35g乙酸铵加水0.5L溶解，然后加入0.5L乙腈， 混合，用乙酸调pH=3.5,过滤，即得流速：0.25mL/min；柱温： 40°C；时间：5 min ；进样量：5uL1.3质谱条件1.3.1以电喷雾电离源（ESI）阳离子模式，气帘气20psi，碰撞 气6,喷雾电压5500V，离子源温度600°C，雾化气是50 psi，辅助 气是50 psi，时间5min。

1.3.2 16种氨基酸的质谱参数，见表11. 4标准品溶液的配制量取16种氨基酸的混合标准品1ml,置于50ml容量瓶，加0.1%甲酸水定容，摇匀即得标准品贮备液1.5供试品溶液的制备精密称取样品约0.1g，置于25ml磨口的具塞比色管内，加6mol/L 盐酸15ml，加入0.2g苯酚，用旋转混合仪和超声仪使样品充分分散 并溶解，充氮气，盖紧塞子，置于110°C 土1°C的恒温干燥箱内，水 解2 2小时，取出冷却，过滤，用纯化水冲洗比色管，将水解液全部 转移至50mL容量瓶中，用纯化水定容至刻度，摇匀，精密吸取ImL 于10mL容量瓶中，置于真空干燥箱内，于40°C〜50°C减压干燥（真 空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂），干燥后残留物用0.1%甲酸 水定容至刻度，摇匀，经0.45um的微孔滤膜过滤，即得1. 6线性实验将标准品贮备液稀释成0.004nmol/ul，0.008nmol/ul， 0.012nmol/ul，0.016nmol/ul，0.020nmol/ul 浓度梯度，每个浓 度以5uL注入色谱系统1.7精密度实验将标准品贮备液稀释至一定的浓度，按色谱、质谱条件进行测定， 连续进样6次。

1. 8加样回收率实验精密称取五分的供试品，每份加入0.020nmol/ul标准品溶液 5ml，定容以5uL注入色谱系统1.9供试品的测定把1.5制备好的供试品溶液，以5uL注入色谱系统以标准液的峰面积和浓度，通过外标法做曲线算出样品的浓度2 结果与讨论2.1色谱行为由于保健品中的氨基酸，用高效液相荧光法要进行柱前衍生，成 本很高而采用液质联用法，不需要衍生，可大大节约成本，用流动相（0.35g乙酸铵加水0.5L溶解，然后加入0.5L乙腈，混合，用乙酸 调pH=3.5）时，5min就能把16种氨基酸全部流出采用液质联用法， 通过MRM模式进行母离子及相应的子离子进行检测，能达到准确的分 离和定量，见图1从左到右，分别为丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、 组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、 苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丝氨酸2.2质谱行为在ESI（ +）阳离子检测方式下，16种氨基酸的质谱定量分析， 在质谱条件下，失去NH3形成[R-CH-COOH]+峰，或失去HCOOH重排 生成[R-CH二NH2]+峰，从而进行色谱分离2.3线性回归方程和最低检测限 以标准品的5个梯度浓度与其峰面积进行线性回归，拟合线性回归方程为Y=aX + b，相关系数r2及最低检测限（S/N （信噪比）=3 时，可测得标准品的最低检测限）见表2。

3 结论本文采用（0.35g乙酸铵加水0.5L溶解，然后加入0.5L乙腈， 混合，用乙酸调pH=3.5）作流动相，经安捷伦EC-C18（4.6mmX50mm, 2.7um）色谱柱，使用液质联用法，能很快把16种氨基酸分离，进 行检测通过测定回收率，精密度，线性关系，表明该方法用于测定 保健品中1 6种氨基酸的含量，结果令人满意参考文献：[1] 万丹晶，陈妙芬，翟咏虹.用HPLC法和氨基酸分析仪测定多 维氨基酸片中18种氨基酸[J].药学服务与研究,2006, 6（3）： 212-214.[2] 屠春燕，赵瑁，葛佳璐，等.新型衍生试剂柱前衍生氨基酸的高效液相色谱分析J].分析测试学报，2008，27（7）： 681-685.[3] 程燕，白敏，石运伟，等.手性氨基酸的毛细管电泳拆分研 究J].分析测试学报，2006，25（2）： 52-55.[4] 倪君君，相婷，李玮，等串联质谱法测定血清中20种游离 氨基酸含量J].检验医学与临床，2010，7（19）： 2051-2053.。