两种韧皮部杆菌媒介木虱内生原核生物和线粒体基因组研究.docx

两种韧皮部杆菌媒介木虱内生原核生物和线粒体基因组研究亚洲柑橘木虱Diaphorinacitri和马铃薯木虱Bactericeracockerelli是农业生产上的重要害虫其中亚洲柑橘木虱为候选的韧皮部杆菌“CandidatusLiberibacterasiaticus(CLas)”和“Ca.L.americanus”的媒介昆虫,该细菌与柑橘黄龙病(CitrusHuanglongbing)密切相关,给全世界柑橘生产造成严重威胁马铃薯木虱主要为害马铃薯、番茄、辣椒等茄科植物,不仅造成“木虱黄叶病”,还是马铃薯斑马病(Zebrachipdisease)病原“Ca.L.solanacearum(CLso)”的媒介昆虫这两种病原菌均为难培养细菌,目前没有有效的药剂进行控制,因此对着两种媒介昆虫的研究和从基因组中获取有用的生物信息对防控柑橘黄龙病和马铃薯斑马病有着重要的指导作用本文首先探索亚洲柑橘木虱和马铃薯木虱的人工饲养方法和获取韧皮部杆菌的规律，得到带菌量高的木虱DNA羊品并用于第二代测序(NextGenerationSequencing,NGS),组装两种媒介昆虫所携带的内生原核生物和线粒体基因组,并进一步分析和应用。

具体研究内容及结果如下:(1)通过比较九里香Murrayaexotica、酸橘Citrussunki和马水橘Citrusreticulate三种寄主不同成熟度的梢对柑橘木虱各龄若虫和成虫存活率的影响,发现柑橘木虱若虫的生长发育依赖于嫩梢,而成虫在成熟梢上的存活率高于嫩梢,且酸橘上饲养效果较好通过研究两个番茄Solanumlycopersicum品种(“Bigboy”和“Yellowpearl")对马铃薯木虱若虫和成虫生物学特性的影响,发现马铃薯木虱在“Yellowpearl”上的4龄若虫和产卵前期更短,且若虫总存活率和成虫存活率显著高于“Bigboy”2)亚洲柑橘木虱和马铃薯木虱的若虫期获菌率和获菌量均高于成虫期,分别在饲菌后第6d和第12d开始达到显著性差异马铃薯木虱成虫获菌效率远高于亚洲柑橘木虱，第18d已达90%HCT值显著下降，而亚洲柑橘木虱只达到33.33%,CT值仍没有显著变化，此时马铃薯木虱的韧皮部杆菌拷贝数约为亚洲柑橘木虱的3倍3)通过两种木虱的测序文库进行组装得到内生原核生物基因组,其中亚洲柑橘木虱样本中获得柑橘黄龙病病原细菌CLasYCPsy株系,原生共生菌”Ca.Carsonellaruddii”YCC琳系,次生共生菌"Ca.Profftellaarmature”YCP麻系的染色体和质粒基因组；另外在该样本组装序列中找到与Wolbachiasp.相关的291个序列。

马铃薯木虱样本中获得马铃薯斑马病病原细菌CLsoRSTMtt系,并首次报导了原生共生菌”Ca.C.ruddii”BC株系和与次生共生菌Wolbachiasp.相关的605个序列4)首次获得亚洲柑橘木虱和马铃薯木虱完整的线粒体基因组其中采自美国加利福尼亚州的马铃薯木虱线粒体全基因组大小为15220bp,采自中国广东省和美国加利福尼亚州的亚洲柑橘木虱线粒体全基因组分别为14996和15013bp三个线粒体基因组均含有13个蛋白编码基因、2个核糖体RNAS因、22个转移RNAS因和1个控制区基因排序均与昆虫原始线粒体的顺序相同通过对马铃薯木虱与GenBank数据库现有三种木虱(枸杞木虱Paratriozasinica,木通木虱Cacopsyllacoccinea和朴树木虱Pachypsyllavenusta)线粒体基因组的13个基因的核酸多态性进行分析,发现cox1基因最保守;对这4个基因组控制区进行比对,发现马铃薯木虱多出一段260bp的特异序列,并能形成3个茎环二级结构基于13个蛋白编码基因构建系统发育树,其结果与基于形态学的分类结果一致采自中国广东省和美国加州的亚洲柑橘木虱的线粒体基因组存在52个变异碱基。

通过3种方法（coxl基因、trnAsn基因和利用3个nad基因的常规PCR）佥证采自中国和美国多个地区的木虱样品,结果表明加利福尼亚州的亚洲柑橘木虱样品可能来源于美国东部地区,为当地黄龙病防控起到理论的指导作用此外,通过两个地区的线粒体基因组的保守区域设计了20对引物,用于扩增采自全球各地区的亚洲柑橘木虱线粒体全基因组,并发现同个样品线粒体的控制区可能存在多种形态完整的木虱线粒体基因组可更好地应用到种群多态性和系统发育分析当中,具有巨大的应用价值。