离子交换层析柱子的选择.docx

离子交换层析技术离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分 离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术一）原理 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交 换剂如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl, DEAE）纤维素在纤维素上结合了 DEAE，含有带正电荷的阳 离子纤维素一O—C6H]4N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换 当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纤维素纤 维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素一O —CH2—COO-），其反离子为阳离子（如Na+等），可与带正 电荷蛋白质阳离子进行交换溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋 白质带负电荷反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷溶液的pH值距 蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多反之则越少血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的 程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为 球蛋白， 球蛋白和 球蛋白。

在适当的盐浓度下，溶液的 pH 值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的 pH 值低于 等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附由于各种蛋白质所带的电荷不同它们与交换剂的结合程度也 不同，只要溶液 pH 值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个 分离开来交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一 个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附当 Cl 一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗 脱，当 Cl 一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱因此，在离子交换层析中，一般采用两 种方法达到分离蛋白质的目的一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的 pH 值 pH 值增高时， 抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱°pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低 了蛋白质对阴离子交换剂的吸附当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值当使用阳离子交 换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液 pH 值二）常用离子交换剂的种类与特性1.离子交换纤维素 离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表 1—1 所示。

表 1-1 离子交换剂的类型与特点交换剂名称（纤维素）作用基团特 点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H氨乙基ae+-o-c2 h4-n h2胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂羧甲基cm—-o-ch2-coo—最常用在pH4以上磷酸P--O- P O2-用于低pH磺甲基sm--o-ch2-so3 -磺乙基SE--O-C2H4-SO3-强酸性用于极低pH在交换纤维素中，最常用的是DEAE—纤维素和CM纤维素由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表 1－2）表1-2商品DEAE—纤维素和C M纤维素的类型和特性纤维素形状长度交换当量（毫克当量/克）蛋白质吸附容量（mg /g牛血清白蛋白）床体积（ml / g）pH 6.0pH 7.6DE-22改良纤维12〜4004507.77.7DE-23改良纤维18〜4004508.39.1（除细粒）1.0±0.1DE-32微粒型（干）24~636606.06.7DE-52微粒型（湿）24~636606.06.3DE-11旧型号50~250130溶菌酶pH5CM-220.6±0.066007.77.7CM-23与以上相应6009.19.1CM-32型号同1 2606.86.7CM-521.0±0.11 2606.86.7离子交换纤维素的优点为：①离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量最大；②离子 基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；③具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广。

2．离子交换交联葡聚糖 离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子交换纤维素不同点是 载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表 1-3表 1-3 常用交联葡聚糖的类型与特性类型性能离子基因反离子总交换容量（毫克当量/g）DEAE-sephadexA-25弱碱性、阴离子交换剂DEAE+Cl—3.5±0.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱碱性、阴离子交换剂QAE+Cl—3.0±0.4QAE-sephadex A-50CM-A- sephadex 25弱碱性、阳离子交换剂CM—Na+4.5±0.5CM- sephadex A-50SP- sephadex A-25强碱性、阳离子交换剂SP—Na+2.3±0.3SP- sephadex A-50离子交换交联葡聚糖有如下优点：①不会引起被分离物质的变性或失活；②非特异性吸附少；③交换容 量大离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定中等分子量（30 000-200 000） —般选A50和 C50，而低分子量（＜30 000和高分子量＞200 000）均宜选用A25和C25三）试验方法阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。

交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡， 不需要除去细粒碎片和酸碱处理其他步骤也基本同离子交换纤维素1•剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴 离子交换剂，反之应选阳离子交换剂一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于 分离碱性蛋白质下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法2.膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团DEAE-纤维素的用量则根据柱 容积的大小和所需过柱样品的量来决定一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml〜8ml柱床体积表1—4分离的血清与所需DEAE —纤维素量及其他条件的大致关系血清样品量（ml）DEAE需用量（g）选层析柱规格（cm）选脱液量（ml）1~221x25100~150552x12200~30010102x20300~40020202x37400~800称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右， 不时搅拌抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为 止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。

再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中， 同样处理，洗至中性3•平衡 将DEAE —纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤 维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的 pH 值与加入的 PB 液的 pH 值相近 时为止4•装柱层析柱的选择要大小、长度适当一般而言，柱长和柱直径之比为10： 1—20 : 1，柱的内径上下 要均匀一致用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部将柱下端连接细塑料 管，夹上螺旋夹把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内 的气泡再将平衡的DEAE —纤维素糊状物沿管壁倒入柱中注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装 拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表 面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制， 至柱床体积不变为止剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床 表面，以免在加样时打乱纤维素层。

装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层 继续平衡，使流出液的 pH 值与流入液的 pH 值完全一致为止5•上样要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4°C ）平衡过夜，中间可换液数次将柱的上端打开，用 吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入沿管壁缓缓加入样品，注 意不要打乱纤维素表层拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml〜2ml缓冲液冲洗 柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的 纯度经过粗提的一球蛋白50mg〜100mg，用干重约4g DEAE—纤维素装柱分离，可获得理想结果6．洗脱 对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使 pH 逐渐降低，而离子浓度逐渐升高一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确表 1 － 5 血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系成分等电点DEAE吸附能力解吸顺序白蛋白4.9强后5.65.17.3弱先表 1 －6 血清的分段洗脱成分NaCl 浓度(Mol/L)0.01Mol/L PB (pH)洗脱部分0.0258.0IgG0.0307.0IgG0.0407.0运铁蛋白、纤维蛋白原0.0606.5白蛋白、IgA0.1506.5IgM白蛋白表 1 －7 各种 Ig 解脱吸附条件不加NaCl PB离子强度（Mol/L）pHIg其他0.018.0IgG0.0258.0IgE0.0357.0IgA0.0405.9球蛋白0.105.8白蛋白0.405.2〜4.5IgM球蛋白7．洗脱液的收集 利用自动分步收集器收集，并以 20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集 至无蛋白液为止。

8•交换柱的再生 将使用过的DEAE—纤维素移入烧杯中，用2Mol/L NaCl液浸泡，抽滤并洗涤数次如 不立即使用，可加1/10 000的叠氮钠防腐，保存于4°C冰箱中使用时，再以碱一酸一碱处理。