蓝藻化感物质《翻译》.docx

从澳大利亚和亚洲分离出的新的抗菌活性藻类对绿藻和蓝藻的 化感作用（翻译）摘要：从澳大利亚、印尼、尼泊尔、泰国和越南的不同生境条件下，新 分离出了 198种蓝藻门的菌株，他们产生的抗菌活性物不受绿藻门空 星藻属、栅列藻属和单针藻属的不利影响我们发现了侧生藻属的十 个菌株、念珠藻属的七个菌株和眉藻属的三个菌株能够产生具有较宽 广光谱的抗菌化合物他们中的有些生物活性的蓝藻细菌能抑制三种 藻类，有些只能抑制两种，有些仅仅能抑制一种另外，这二十种有 效的菌株也通过了其他几种蓝藻细菌的筛选这几种蓝藻细菌包括： 在有光的自养条件下和黑暗的异样条件下均生长良好的项圈藻 doliolum ；在澳大利亚和世界其他地方产生影响的三种有毒物种—— Microcytis aeruginosa, Anabaena circinalis 和 Nodularia spumigena至少有一种侧生藻属产生的生物活性物质会阻碍海藻叶绿体中 光合作用的电子传递，虽然其他一些种类并不影响光合作用在大多 数情况下，生长抑制效果在有蛋白酶的存在条件下进行测试本文的 结果依据自然中合理的化学抑制、竞争和藻类种群的相互克制而讨论 得出的。

关键字：筛选、蓝藻、绿藻、抗菌素、生物活性化合物、抗生作 用、化感作用简介：微生物群的科学和商业利益被证明是它具有丰富的天然活性产 物来源广泛的蓝藻细菌筛选计划，尤其是在70 年代后期开展的计 划导致了新型的抗肿瘤、抗菌和抗病毒性质的化合物的发现 (Patterson et al., 1991, 1993, 1994; Moore,1996; Falch et al., 1995; Kulik, 1995).通常情况下，从蓝细菌中分离出的生物活性化合物主要有两种 用途其一师为了发现能应用于药学、农业和生物控制的新型化合物； 另外一种则是为了更好的理解单个有机体和他们所在的自然群落之 间的相互作用两种目的都需要从自然种群中筛选新的可培育有机 体，并且要了解生物活性菌株的分布和频率当前我们主要描述从广 泛的生境和地点筛选出的 198 中独立的蓝细菌对绿藻和蓝藻的抑制 作用材料和方法Cultivation of cyanobacteria 蓝细菌培育主要是从澳大利亚、印尼、尼泊尔、泰国和越南的土壤和淡水样 品从分离出来蓝细菌样品放置于Allen and Arnon (1955中，用NaNO3(10 Mm)和高浓 度的NiSO4（四倍标准浓度，aday & Smith, 1983）处理，在斜床上用 低连续的 cool-white u-orescent 照明条件下生长。

通过早期描述方法 将蓝细菌基本提纯（de Chazal & Smith, 1996; de Chazal et al., 1992）.不确定的单种藻污染通过显微观察来确定，如果有必要则用深度 镀层方法重提纯一种从Macrozamia中分离出的念珠藻物种作为生 产和指示菌株而被测试接下来的提纯程序中，将固氮微生物培养基 上的 NaNO3 删除用于筛选的细胞置于锥形烧瓶中，暴露在空气中，在250C连续 低光照条件下培养几个星期至几个月后直接应用用于生理性实验的 细胞在置于亮度为110umol辐射量子的喷洒0.3%的CO2空气中，16:8 的明暗交替循环中培养为了能再黑暗下进行自养生长，添加了 10mM的果糖（如果是培养集胞藻属和念珠藻属的则可以用葡萄糖代 替）至U培养基中光和作用的光是用LI-185 Li-cormeter模型测定的 用于筛选的细胞置于锥形烧瓶中，暴露在空气中，在250C连续低光 照条件下培养几个星期至几个月后直接应用绿藻及其培养筛选抗菌活性物质 藻类叶绿素的分离 为了分离藻类叶绿素我们将细胞放在置于亮度为 110umol 辐射量子的，有磁场震动的0.3%的 CO2空气中，16:8的明暗交替循 环中培养。

在用玻璃球将细胞打破后，用Berzborn和Bishop的微调 方法来准备叶绿体氧气交换氧气交换是通过一个3mL的氧气电极来测定的为了完整细胞 的氧气变化，将细胞生长介质加入到培养基中为了光依赖型 的氧气变化（希尔反应）和通过梅勒反应摄取分离藻类的叶绿素， 我们增加了适当的电子供体和受体结果:抑制绿藻的生物活性蓝细菌的筛选 我们分离出了 198种蓝细菌的菌株，大部分是从澳大利亚和印尼 所采集的样品中分离出来的，当然也有一些事来自尼泊尔、泰国和越 南新菌株包括了巴斯德协会分类系统的五种典型蓝藻（Rippka et al., 1979）.包括两种新增的菌株在内，所有的菌株均通过细菌培养获得， 并且通过了绿藻门的三个物种的筛选（这三种分别为尖细栅藻、小空 星藻and Monoraphidium convolutuni有二十中蓝细菌抑制绿藻的生 长十种是侧生藻属的物种，其中五种来源于印尼（瓜哇岛和龙目岛）， 一种来自越南，一种来自尼泊尔（加德满都），两种来自于澳大利亚 首都直辖区，一种来自其北部地区 七种是念珠藻属的物种，三种 来自于印尼（龙目岛），三种来自于西澳洲，一种来自于新南威尔士 洲 同时也有三种从西澳洲和澳大利亚首都直辖区分离出的眉藻属 物种。

大部分分离出的具有生物活性的菌株是固着生长的，他们主要 是从坚硬的土壤表面、建筑物墙体、排水管和海贝中分离出来的通过蓝细菌清除绿藻被分离出的二十种生物活性蓝藻主要影响的藻类列在表2 中，并 附着筛选试验的结果同时也显示了添加蛋白酶 K 对含高琼脂含量 的藻类培养基的影响通过蛋白酶阻碍清除表明一种缩氨酸是活化 剂，虽然因为很多蓝细菌的缩氨酸是由不寻常的氨基酸构成而未能被 证实清除模式表明在自然和专一的蓝藻活性物质对藻类的影响上都 有相当大的变异例如：侧生藻JAVA 94/20和眉藻WA 96/8清除三 种藻类不是通过影响蛋白酶的活动侧生藻 NEP 95/1 在蛋白酶存在 的情况下彻底的摧毁 Monoraphidium, 同时清除空星藻是在不受蛋 白酶的影响活动产生的它对栅藻的生长不产生影响不管是否有蛋 白酶存在，侧生藻LOM 95/17只清除空星藻的物种有趣的是，没 有一种念珠藻属的物种能清除空星藻，然而空星藻却被所有的侧生藻 和眉藻菌株所清除然而，大部分念珠藻属的菌株却活跃的对抗另外 两种藻类；在一种情况下（念珠藻WA 96/19对抗栅藻）的清除只有在 有蛋白酶的情况下才会出现一般来说，值得注意的是清除活性与菌 株的培养年龄和加入培养基中的材料的数量有关。

有些情况下在一 个试验中观察到藻类清除的断言在接下来的试验中却不明显了，直到 这些变量的改变因此，有可能筛选结果是低估了生物活性菌株数量 的代表蓝细菌清除其他在自养和异样条件下的蓝细菌这二十种分离出来对绿藻有活跃抗性的菌株也进行了对其他蓝 细菌成长的杀害和抑制性测试从苏铁属植物Macrozamia communis L. Johnson 中分离出的 A. doliolum ATCC 43530, 集胞藻属 PCC 6803 和念珠藻属物种最初选择为指示菌株，因为他们能够在黑暗进行非自 养生长这样的有机体为我们演示了清除活动是否直接影响光合作用提供了可能对A. doliolum影响的整套观察活动见表3.如绿藻，对不 同菌株多种模式的清除被观察，其中一种情况（念珠藻属NSW 95/10 在光合自养条件下地生长），只有在有蛋白酶的情况下有显著的活动A. doliolum在光合自养生长期间被侧生藻属JAVA 94/20清除，但是在黑暗中异样生长却不被清除令人惊讶的是我们也观察到，当 镀成试验设置在黑暗中时，仅仅在开灯以后清除影响就开始启动这 表明这种生物产生的生物活性物直接影响光合作用机制的一些部分， 尽管一种可选择的解释是侧生藻在阳光下产生更多的生物活性物。

侧 生藻 NEP 95/1 在有光和黑暗条件下都活跃对抗项圈藻，而在蛋白酶 的影响下却消失了，这表明某种缩氨酸是活化剂且它不指导对抗光合 作用的生物化学过程另外侧生藻sp. JAVA 94/20, NEP 95/1, LOM 95/17 and 眉藻 WA 96/8 也进行了对来自在光和自养条件下生长的 普通大泽米属的集胞藻 PCC 6803和念珠藻的对抗测试 与之相反， 眉藻仅仅只清除 A. doliolum.最后，对这二十中生物活性菌株也进行了杀害有毒蓝细菌能力的 测试铜绿微囊藻、卷曲鱼腥藻和泡沫节球藻如表4 所见， 14 中 被分离出的蓝细菌能杀死其中一种或多种菌株，有些具有巨大的潜力抑制含氧的光和作用为了证实光依赖型清除能光合自养生长的A. doliolum ,(表3) 就抑制光合作用电子传递进行了解释，藻类叶绿素的氧气交换测量值 的测定通过对侧生藻物种JAVA 94/20的可溶解行细胞提取物来测定 分离的叶绿素被应用是因为观察到对完整细胞氧气变化的测量没有 影响，可能是由于很短时间的这种实验相对于完整细胞内活性物质扩 散时间对电子传递位置的抑制通过甲醇(30mL)提取冻干细胞(0.5g) 30 分钟，提取两次。

将提取液进行离心后将上层清液蒸干将残渣 再溶解与 1.5mL 的甲醇后能整除的部分用于实验，干燥后在溶解于 50uL的乙醇细胞提取液等同来源于23mg的冻干粉末在培养十分 钟后测定比率在对照实验中,Mehler和Hill反应速率分别为76和 32 umol h-1 (mg chloroplast)-1. 提取液的数据表明分别被抑制了 75%和 68% 相比之下，光下和黑暗下生长的具有抑制性的侧生藻 NEP 95/1 的光和作用活性没有影响通过蛋白酶抑制清除flores和wlok提出有些蓝细菌菌株，例如Nostoc sp.ATCC29132, 通过产生一种隐藏的蛋白质来抑制抗菌素的活性来保护他们自己和 其他物种在本实验中可以明显看出在蛋白酶K的存在下，同样的 念球藻清除眉藻WA96/8在没有蛋白酶K的条件未进行测定和上 述提到的一样（念珠藻属WA96/19抑制栅列藻属，念珠藻NSW95/10 抑制在自养生长条件下的A.doliolum）,这样的现象在我们分离的两 种念珠藻属中也可以看到讨论 蓝细菌能产生广泛的生物活性物质，其中包括藻类对抗物在目 前的工作中，有 198种新分离出的蓝细菌被测试（表1），二十种能 产生能抑制绿藻生长的生物活性物质（表 2）。

分离出的生物活性菌 株的比例（约为 10%）与更早出版的其它种类的筛选进行了比较（11%， Flores and Wolk , 1986; 7%, Patterson et al., 1993） 因为诸葛工作最初的目的是测试哪种蓝细菌能杀害绿藻，所以我 们没有对所有的蓝细菌做抵抗测试；Flores和Wolk在1986年已经 通过一系列的生产和目标有机体的研究对这样的筛选性实验进行了 报道可以预计在这198种分离的菌株中会有更多对蓝细菌长生活跃 抵抗的菌株由于这些分离的菌株是为了表明清除绿藻而做了抵抗蓝 细菌的测试，所以关于生产性菌株对蓝细菌的清除频度是无可奉告 的，除此之外Flores and Wolk在1986年发现的11%的价值可能更接 近 做生物活性菌抵抗蓝细菌测试的部分原因是为了找到有活性， 能杀害有毒蓝细菌的菌株有毒蓝细菌对世界上很多地方的公共安全 具有相当大的威胁 （Carmichael, 1992, 1997; Falconer,1998）, 这三项 研究在澳大利亚形成了相当严重的问题，详见（Blackburn etal., 1997）, 据 Bagchi 等 1993 研究：一种颤藻能产生对铜绿微囊藻抗菌活性抵抗的物质。

一些大型植物也作为这样的生物活性合成的资源被报道 （Nakai 等，1996）. 由表 4可见，侧生藻、可能也有念珠藻的一些物种似乎能 。