ncbi基本功能与引物设计.ppt

NCBI常用功能与引物设计,2010级博士：谢鹏,导师：邹晓庭,Your site here,为何要接触NCBI？,如何使用NCBI？,如何设计引物？,Your site here,NCBI简介,NCBI：National Center for Biotechnology Information 美国国家信息技术中心 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）,1992年10月，NCBI承担起对GenBank DNA序列数据库的责任NCBI工作人员通过来自各个实验室递交的序列和同国际核酸序列数据库（EMBL和DDBJ）交换数据建立起数据库.,Genebank是遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列的注释过的收集 GenBank以指数形式增长，核酸碱基数目大概每14个月就翻一个倍最近，GenBank拥有来自47,000个物种的30亿个碱基Sub title,NCBI常用功能,,查找核酸/氨基酸序列,序列相似性分析,引物验证,Your site here,一、查找核酸、氨基酸序列,1.以鸡FAT/CD36为例，search：,2.调整右侧检索目录，tree--list：,,,Your site here,3.浏览信息，下载序列，并以Genebank、FASTA格式保存,点击Genebank:,,,,,,,,氨基酸序列：,Genebank核酸序列：,… …,FASTA格式的核酸序列：,,,… …,Your site here,二、序列相似性分析,序列相似性分析： 就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。

完成这一工作只需要使用两两序列比较算法常用的程序包有BLAST、FASTA等 序列同源性分析： 是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小这是理论分析方法中最关键的一步完成这一工作必须使用多序列比较算法常用的程序包有DNAMAN、CLUSTAL等,Blast简介,BLAST ： “局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool)的 缩写，是由NCBI开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序主要的Blast程序：,,,Blast 序列相似性分析,1.修改测序结果，剔除克隆载体序列,在测序结果中找到上下游引物对应位置，剔除引物外的多余部分,以鸽子的I-FABP片段为例：,GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT… …,上游引物：5‘-AGRAARYTDGSAGCYCAC-3’ 下游引物： 5‘- TCHGTYCCRTCWGCBAGA-3‘,,,,TAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGA,Your site here,2.进入NCBI 3.点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项,Your site here,,,,,,,Your site here,4.寻找相近物种，比较相似性,,,,,,Your site here,,,,,点击score，获得相似性比较具体信息,NCBI官方说明：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/tutorial/Altschul-1.html,Your site here,引物设计与简并PCR,RT－PCR原理与技术简介 引物设计过程 简并PCR技术 后续研究,Your site here,RT－PCR原理与技术简介,DNA mRNA 蛋白质,酶活力 Western blot,Northern blot 半定量RTPCR 定量RTPCR,Your site here,RT－PCR原理与技术简介,,1,2,Your site here,常规引物设计,引物设计原则 Primer5和Oligo6进行引物分析,Your site here,引物设计原则,引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度。

引物3’端的序列要比5’端重要引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败5’端序列对PCR 影响不大 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比 ΔG值(自由能)反映引物与模板结合的强弱程度一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值） 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带Your site here,以鸡的I-FABP为例，设计常规引物：,1.输入I-FABP的已知序列，点击primer:,,Your site here,2.点击search进行引物条件设置：,,,,,,,,3.Search criteria 筛选,,,,,,,Your site here,4.选择最优引物,5.手动修改，调整引物,,,Your site here,Blast 引物验证,最为重要的环节：对自己设计的引物或文献报道的引物进行测试,1.登陆NCBI——Blast——Primer-BLAST: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/,,Your site here,以文献报道鸡的MUC2的引物为例：,,Your site here,,,,Your site here,,,Your site here,简并引物设计,More of an art than a science 降低简并度（500以下） 例如：上游 D Y N L F D L L 下游 P V N G N G K Q 根据密码子表建立引物系列http://www.kazusa.or.jp/codon/ 谨慎使用次黄嘌呤,GAYTAYAAYYTNTTYGAYYTNYTN,CCNGTNAAYGGNAAYGGNAARCAR,Symbol Definition B not A D not C H not G I Inosine K G or T/U M A or C N A,C,G or T/U R A or G S C or G V not T/U W A or T Y C or T/U,简并引物：在常规引物的某些位点上以简并核苷酸代替。

Your site here,简并引物设计过程,传统方法（适用于保守度高序列） 应用BLAST进行同源序列搜索 应用DNAMAN选择保守区域（氨基酸或核苷酸） 简并引物设计原则 Primer5和Oligo6进行引物分析 CODEHOP法（适用于保守度低序列）,Your site here,应用BLAST进行同源序列搜索,剪切然后粘贴DNA或蛋白序列； 使用FASTA格式的序列； FASTA格式的序列以一个单行的说明开始，说明行以其开始处的一个大于号（）与序列数据区分开说明行以下是序列数据 简单使用访问编号：RefSeq或Genebank序号 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,Your site here,Your site here,DNAMAN分析序列保守区,对Gallus、Taeniopygia、Mus、Ruttus的I-FABP的CDS进行分析得到保守区序列,,Your site here,CODEHOP,原理 方法： http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html,,Your site here,简并PCR技术,,,,,,RNA,cDNA,cDNA,反转录,合并产物,分装产物,,,,,,β-actin,样 品,PCR,Your site here,简并PCR技术,使用标准的反应体系并适当增大引物浓度（1-3 µM） 退火温度是最关键点： 采用Touchdown方法优化条件 采用梯度PCR优化条件 使用热启动PCR 循环数增加至50 cycles 电泳检测至关重要 不用二次扩增重复结果,Your site here,应用半定量或定量PCR法研究营养物质等对该基因表达水平的影响 使用RACE法进行基因cDNA全长扩增 进行蛋白质结构预测 原核表达 系统进化树 为RNAi法研究基因功能提供基础,后续研究,,Thank You!,。