实验一细胞形态多样性及细胞计数.ppt

实验目的】【实验目的】 了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法实验一实验一 细胞的形态观察和细胞计数细胞的形态观察和细胞计数【实验原理】【实验原理】 1、细胞形态观察、细胞形态观察 根据体外培养细胞在培养时，是否能贴附于支持物上生长，可将其分为贴附型生长细胞和悬浮型生长细胞两大类贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长，一般有两种形状，即表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长悬浮型细胞在培养中悬浮生长 大多数细胞是贴附型生长的当细胞贴附在支持物上后，细胞的形态失去它们在体内时的原有特征，在形态上表现单一化的现象 　　此细胞形态与体内成纤维细胞的相似而得名，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出２～３个长短不齐的突起细胞在生长时呈放射状火焰状或旋涡状走行，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织细胞常呈此形态成纤维细胞型成纤维细胞型上皮细胞型上皮细胞型　　 本型细胞呈扁平不规则多角形，中有圆形核细胞彼此紧密相连成单层膜，生长时呈膜状移动；处于上皮膜边缘的细胞总与膜相连，很少脱离细胞群单独活动；起源于内、外胚层细胞如皮肤表层、消化层上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆呈上皮型形态。

　　此型细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片，细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞相区别，在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能呈成纤维细胞形态 游走细胞型游走细胞型　　有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定他们规律和稳定的形态，可通归入多形细胞型 多形细胞型多形细胞型悬浮型悬浮型 有的细胞在培养时不粘附于支持物上有的细胞在培养时不粘附于支持物上,而是呈悬浮生长状态而是呈悬浮生长状态,如某些癌如某些癌细胞和血液白细胞细胞和血液白细胞　　细胞悬浮生长时胞体为圆形细胞悬浮培养的优点是细胞生存空间大　　细胞悬浮生长时胞体为圆形细胞悬浮培养的优点是细胞生存空间大,生长时间长生长时间长,能繁殖出大量细胞能繁殖出大量细胞　　培养细胞形态的分类　　培养细胞形态的分类,主要是根据细胞在培养中的表现以及描述上的主要是根据细胞在培养中的表现以及描述上的方便而定它可受很多因素的影响而发生变化当细胞处于较好的培养条方便而定它可受很多因素的影响而发生变化当细胞处于较好的培养条件时件时,形态上有相对的一致性形态上有相对的一致性,在一定的程度上能反映细胞的起源以及正常在一定的程度上能反映细胞的起源以及正常和异常的区别。

但培养条件是很难控制的，难免不发生变化如和异常的区别但培养条件是很难控制的，难免不发生变化如CO2浓度，浓度，培养液的培养液的PH,支原体的产生支原体的产生,包括细胞接种密度等包括细胞接种密度等,都会影响细胞形态悬都会影响细胞形态悬浮型和贴附型的性质也不是一成不变的在一定条件下浮型和贴附型的性质也不是一成不变的在一定条件下,悬浮型细胞可呈悬浮型细胞可呈贴附状生长由于培养细胞形态的易变性贴附状生长由于培养细胞形态的易变性,在利用形态学指标判定细胞类在利用形态学指标判定细胞类型和其它一些变化时型和其它一些变化时,应参考多方面指标应参考多方面指标,必要时应利用电镜来提供形态学必要时应利用电镜来提供形态学依据sp2/01.细胞种类：小鼠骨髓瘤细胞2.培养的天数：复苏后12小时；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：DMEM+6%FBS；5.细胞状态与特征简述:细胞呈圆型或椭圆形 培养细胞形态分析培养细胞形态分析 贴壁细胞在生长状态良好时，胞体细长、胞浆清亮，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，细胞长成单层时呈漩涡状排列；悬浮细胞当表现出边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之，则较差或已死亡。

在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大；细胞内颗粒较多，透明差，空泡多 若细胞胞体肥大、胞浆内混浊、颗粒增多、折光性下降、变扁平透明，细胞核明显增大、细胞排列极不规则则，细胞可能已经衰老 培养基内有pH指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡当细胞生长状态良好时，培养液应清澈透明，悬浮的细胞和碎片很少当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能 实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞肿瘤细胞有重叠生长的特征  1、细胞形态观察、细胞形态观察 （l）将细胞培养瓶从37℃二氧化碳培养箱(或温箱)中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度，然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。

（2）打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度 （3）调节粗调旋钮调整物镜的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构，在观察时，最经常使用的是10X物镜实验内容】【实验内容】细胞形态多样性及细胞计数细胞形态多样性及细胞计数 一一. . 实验原理实验原理 当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中的细胞数目 1.1.血球计数板的构造血球计数板的构造 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用这一大方格的长和宽各为1mm，深度0.1mm为，其体积为0.1mm3Volume = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm= 0.1 mm3= 1 x 10-4 cm3 = 1 x 10-4 mL若该体积内有n个细胞则，則细胞浓度为= n個 / (1 x 10-4 mL)= n x 104 個/mL(若有稀释再乘以稀释倍数)常使用計數ABCD四區域有n個細胞，則細胞濃度為= n / 4 x 104 （個/mL）p細胞計數時，細胞濃度不要太稀，太稀準確度會比較低，最好在1～3 x 106 個/mL1 mm1 mmHemocytometer (血球計數器)ABCD由此滴加樣本二二. .试剂与器械试剂与器械 器材器材 : :光学显微镜、血细胞计数板。

光学显微镜、血细胞计数板三．实验步骤三．实验步骤1.1.取血细胞计数板，加盖玻片盖住两边的小槽取血细胞计数板，加盖玻片盖住两边的小槽2.充充液液：：用用小小滴滴管管将将一一小小滴滴稀稀释释悬悬液液滴滴在在盖盖玻玻片片边边缘缘的的玻玻片片上上，，使使稀稀释释液液借借毛毛细细管管现现象象自自动动渗渗透透入入计计数数室室中中如如滴滴入入过过多多，，溢溢出出并并流流入入两两侧侧槽槽内内，，使使盖盖玻玻片片浮浮起起，，体体积积改改变变，，会会影影响响计计数数结结果果，，需需用用滤滤纸纸把把多多余余的的溶溶液液吸吸出出，，以以槽槽内内没没有有溶溶液液为为宜宜如如滴滴入入溶溶液液过过少少，，经经多多次次充充液液，，易产生气泡，应洗净计数室，干燥后重做易产生气泡，应洗净计数室，干燥后重做3.3.计计数数：：充充液液后后静静止止1-21-2分分钟钟，，待待细细胞胞下下沉沉后后，，方方可可进进行行计计数数计计数数四四角角及及中中央央共共5 5个个中中方方格格内内的的2020个个小小方方格格中中所所有有红红细细胞胞数数，，计计数数时时为为了了防防止止重重复复和和遗遗漏漏，，应应按按一一定定的的顺顺序序，，先先自自左左向向右右数数到到最最后后一一格格，，下下一一行行格格子子则则自自右右向向左左，，再再下下一一行行又又自自左左向向右右，，即即呈呈S S形形计计数数。

对对于于分分布布在在刻刻线线上上的的红红细细胞胞，，依依照照““数数上上不不数数下下，，数数左左不不数数右右““的的原原则则进进行行计计数数计计数数时时，，如如发发现现各各中中方方格格的的细细胞胞数数目目相相差差2020个个以以上上，，表表示示细细胞胞分分布不均匀，必须重新计数布不均匀，必须重新计数四四. . 注意事项注意事项 防止液体滴入过多，否则溢出并流入两侧槽内，会使盖防止液体滴入过多，否则溢出并流入两侧槽内，会使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果玻片浮起，体积改变，会影响计数结果五五. . 实验结果实验结果血球计数板的清洁血球计数板的清洁 血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。