教学课件第四节细菌和链霉菌的分子克隆载体.ppt

第四节细菌和链霉菌的分子克隆载体细菌和链霉菌的分子克隆载体      一、革兰氏阴性菌克隆载体一、革兰氏阴性菌克隆载体        1. 移动载体（移动载体（mobilizable vector））           1) 特点特点            i.  广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范围围            ii.  DNA的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于辅助质粒，辅助质粒，DNA进入中间宿主细胞可用直接转化进入中间宿主细胞可用直接转化         2) 结构结构            i. RK2质粒的结构质粒的结构                a. oriV DNA复制起点复制起点                b. DNA复制基因复制基因                c. DNA转移基因转移基因                d. oriT DNA转移基因转移基因                e. 药物抗性基因（药物抗性基因（Apr Kanr Tcr））G+菌菌的的质质粒粒和和载载体体  ⅱ. 移动载体与辅助质粒移动载体与辅助质粒           pRK2013: 将将RK2中的全部转移基因和中的全部转移基因和Kanr基因插入到基因插入到 E.coli的的colE1质粒中构成辅助质粒质粒中构成辅助质粒           pRK290: 余下部分（余下部分（Apr除外）构成移动载体（约除外）构成移动载体（约20Kb））     *    当选用当选用E.coli为中间宿主时，必须先将为中间宿主时，必须先将pRK290经过直接经过直接转化引入转化引入E.coli（（pRK2013也应转入同一细胞）。

当要转移也应转入同一细胞）当要转移pRK290时，只需将时，只需将E.coli细胞与其他细胞与其他G‐细胞混合，在细胞混合，在pRK2013的作用下，的作用下，pRK290可可接合转移接合转移至终宿主细胞至终宿主细胞   3)  不相容群不相容群（（incompatibilitiy group）克隆载体）克隆载体    ⅰ. P群：群：RP4  RK2  RP1 R68                  2-5拷贝拷贝    ⅱ. Q群：群：R300B  RSF1010  R1162      15-20拷贝拷贝    ⅲ. W群：群：Sa                                               2-5拷贝拷贝   4））遗传标记基因遗传标记基因大多数为抗生素标记基因，要注意不同大多数为抗生素标记基因，要注意不同G‐菌中的表达活性菌中的表达活性G-细菌中重组质粒的转移细菌中重组质粒的转移 2. 非移动载体非移动载体(non-mobilizable vector)     1) 特点特点：不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体     2) 实例实例： P4D0105-由由E.coli噬菌体噬菌体P4构建而成，适合于构建而成，适合于E.coli和肺炎克蕾伯氏菌。

和肺炎克蕾伯氏菌       ⅰ. 当辅助噬菌体提供当辅助噬菌体提供P4整合酶时，该载体可整合到整合酶时，该载体可整合到E.coli染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无关        ⅱ. 该载体含有一个该载体含有一个virl突变和在引物酶基因突变和在引物酶基因α中存在一个中存在一个琥珀突变琥珀突变(am52)，在无抑制子突变的菌株中，该载体不，在无抑制子突变的菌株中，该载体不能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中(琥珀抑制子琥珀抑制子突变体），该载体则可自主复制突变体），该载体则可自主复制P4D0105载体的结构载体的结构 二、革兰氏阳性菌（二、革兰氏阳性菌（G+）克隆载体）克隆载体    1.枯草杆菌克隆载体枯草杆菌克隆载体        1））B.subtilis作为宿主菌的优点作为宿主菌的优点             ⅰ. 芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程            ⅱ. 遗传背景较清楚，可直接导入外源遗传背景较清楚，可直接导入外源DNA             ⅲ. 非致病细菌，因而安全非致病细菌，因而安全            ⅳ. 研究结果可用于其它芽孢杆菌研究结果可用于其它芽孢杆菌            ⅴ. 存在各种分泌蛋白质存在各种分泌蛋白质       2））B.subtilis作为宿主菌的缺点作为宿主菌的缺点             ⅰ. 存在多种蛋白酶基因和相应产物存在多种蛋白酶基因和相应产物              ⅱ. 外源外源DNA导入细胞后不稳定，易发生重组反应导入细胞后不稳定，易发生重组反应 3)克隆载体克隆载体   ⅰ.复制子来源复制子来源       i) 质粒质粒DNA 质粒名称质粒名称     大小大小(kb)    标记基因标记基因     拷贝数拷贝数       来来    源源    pUB                  4.5              Kanr                50      金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌    pE194               3.7              Eryr                 10              同上同上    pC194               2.9              Cmlr                                  同上同上    pSA0501          4.1               Strr                20-50          同上同上     pBC61                                                                     蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌    pLS103                                                                       B.subtilis    pFTB14                                                                淀粉液状芽孢杆菌淀粉液状芽孢杆菌    pAB124                                 Tcr                          嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌    pTB19             25.8            Kanr Tcr                                            同上同上    pT181               4.4                Tcr                                          蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌    pCW7                                                                             同上同上    pAMα1                                                                     S.faecalisii) 噬菌体噬菌体          Ф105   39.2kb   B.subtilis                                                          温和噬菌体温和噬菌体       Q11       90kb      同上同上              当外源当外源DNA插入上述载体时，插入上述载体时，Ф105生长的功能丧失生长的功能丧失,当重当重组组DNA分子转入已含有分子转入已含有Ф105的溶源化菌株时，重组的溶源化菌株时，重组DNA分分子可以十分有效地插入染色体子可以十分有效地插入染色体DNA中。

这种技术称之为中这种技术称之为"原原噬菌体转移技术噬菌体转移技术"    ii.   标记基因标记基因      ⅰ) 抗生素抗性基因抗生素抗性基因      ⅱ) thy基因基因(三甲氧苄二氨嘧啶三甲氧苄二氨嘧啶)：该基因表达可导致枯草：该基因表达可导致枯草杆菌死亡，但当外源杆菌死亡，但当外源DNA插入该基因后，宿主细胞便插入该基因后，宿主细胞便能存活能存活      iii.  表达载体的启动子表达载体的启动子                   常用的有液化芽孢杆菌的常用的有液化芽孢杆菌的α-淀粉酶基因启动子和淀粉酶基因启动子和sp2启动子启动子   2. 其它其它G+ 克隆载体克隆载体      1) 枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌色葡萄球菌     2) 嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒所组建的克隆载体所组建的克隆载体三、链霉菌克隆载体三、链霉菌克隆载体   1. 质粒载体质粒载体质粒名称质粒名称    大小大小(kb) 　　  来源　　　　来源　　　　   宿主范围宿主范围           拷贝数拷贝数 SLP1.2           14.5      天兰色链霉菌   窄谱,变青链霉菌 　   4-5 SCP2(性因子)   ″              ″                           ″                    1-3 pIJ101　　      8.9      变青链霉菌    广谱(各种载体构建)  40-300 pFJ103             20     S.granulorubor  生二素,金霉素,弗氏链霉菌                        pUC6                9.2    S.cepinosue                     广谱                30-40   2. 噬菌体载体噬菌体载体     ΦC31-天兰色链霉菌的温和噬菌体，长天兰色链霉菌的温和噬菌体，长41 kb，其中，其中32 kb是必须的是必须的, 具粘性末端的线状具粘性末端的线状DNA分子，可插入约分子，可插入约10 kb外外源源DNA，可裂解和溶源化生长。

可裂解和溶源化生长 3. 标记基因标记基因        杂合致死杂合致死（（lethal zygosis,Ltz)lethal zygosis,Ltz)：凡是含有接合质粒的：凡是含有接合质粒的链霉菌可在一受体链霉菌菌丝体上形成麻点，这种转移可导链霉菌可在一受体链霉菌菌丝体上形成麻点，这种转移可导致受体菌生长受到抑制，常用的受体菌是变青链霉菌，这种致受体菌生长受到抑制，常用的受体菌是变青链霉菌，这种表型也可用于转化体的选择表型也可用于转化体的选择           第四节第四节         真菌分子克隆载体真菌分子克隆载体一、酿酒酵母一、酿酒酵母(Saccharomycea cerevisiae)的的分子克隆载体分子克隆载体   1.克隆载体的种类克隆载体的种类           1) 按复制方式划分按复制方式划分              i.   自主复制型；自主复制型；             ii.  整合型（非自主复制型）整合型（非自主复制型） Yeast Integration plasmid(YIp)         2)按复制子来源划分按复制子来源划分               i. 附加体型附加体型- yeast episomal plasmid(YEp)，其复制起，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒点来自于酿酒酵母的天然质粒-2μ质粒质粒             ii. 染色体复制型染色体复制型- Yeast Replicating plasmid(YRp)，其，其复制起点来自染色体上的自主复制序列复制起点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomous replicating sequence)酿酿酒酒酵酵母母载载体体的的种种类类和和构构建建          *  若在若在YRp中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体体YCp-Yeast Centrometric plasmid          ** 若在若在YCp 或或YRp 中插入一段酵母的端粒结构，该中插入一段酵母的端粒结构，该质粒称之为质粒称之为YLp-Yeast Linear plasmid         *** 若将若将YLp质粒构建成环状分子质粒构建成环状分子,该质粒称之为该质粒称之为pYAC载体载体(Yeast Artificial Chromosome)   3)  标记基因标记基因 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如基因作为选择标记，如ARG4ARG4，，LEU2LEU2，，TRP1TRP1，，HIS3HIS3和和URA3URA3。

使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在靠在E.coliE.coli的转化体中来鉴别的的转化体中来鉴别的  2. 酵母克隆载体的结构与特点酵母克隆载体的结构与特点        1) 穿梭载体，穿梭载体，YIp除外除外       2) 有适合两种生物的标记基因有适合两种生物的标记基因       3) 环状或线状环状或线状DNA 详见下表详见下表 载体类型载体类型    存在方式存在方式    所需所需DNA序列序列  标记基因标记基因    转化频率转化频率          稳定性稳定性                                                                 （菌落（菌落/μgDNA）无丝分裂）无丝分裂    有丝分裂有丝分裂  整合型整合型         整合整合        与染色体与染色体DNA    Apr Tcr          <10               +a               +a       (YIp5)      1-几个拷贝几个拷贝        同源同源               URA3                                        附加体型附加体型   自主复制自主复制         2μ质粒质粒         Apr Tcr           103-104            -b                -c (YEp13)       多拷贝多拷贝                                    LEU2   复制型复制型       自主复制自主复制           ARS             Apr Tcr         103-104            -b                -c (YRp7)        多拷贝多拷贝                                   TRP1         着丝粒型着丝粒型   染色体状染色体状       ARS,CEN          Apr            103-104           +d                +d (YCp19)    通常单拷贝通常单拷贝                         TRP1,URA3 线型线型          染色体状染色体状       ARS，，CEN  TRP1，，HIS3 103-104           +e                +   (YLp21)    通常单拷贝通常单拷贝         TEL a. 每次细胞分裂仍有约每次细胞分裂仍有约1%的载体的载体DNA从染色体上脱落下来从染色体上脱落下来b. 在选择培养基中在选择培养基中15-20代后，代后，10-30%的转化子丢失载体的转化子丢失载体DNAc. 非孟德尔式分离，主要是非孟德尔式分离，主要是4+：：0-d. 无丝分裂时有无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离转化体质粒不发生分离在选择培养基上丢失质粒的转化体低于在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1% 1% 酿酒酵母各种载体的特征酿酒酵母各种载体的特征3. YIp载体载体 该类载体只有依靠本身携带的酵母基因与酵母染色体上的同源该类载体只有依靠本身携带的酵母基因与酵母染色体上的同源DNADNA整合到染色体上去。

这种转化体十分稳定，但也可能发生第整合到染色体上去这种转化体十分稳定，但也可能发生第二二次同源重组次同源重组( (见图见图) )可用杂交方法证明整合和二次重组结果（如可用杂交方法证明整合和二次重组结果（如图所示）图所示）     I.  宿主宿主DNA; II和和III. 转化子转化子DNA(10道除外道除外); I和和II. LEU基因为探针基因为探针; III. pBR DNA为探针为探针; E1/道道1, 4, 7; E2/道道2, 5, 8; E1-E2/道道3, 6, 9和和10.假设上述假设上述YIp质粒长质粒长6 kb, E1-E2双酶切得双酶切得2 kb和和4 kb两片段两片段; 宿主菌染色体上标记基宿主菌染色体上标记基因用因用E1酶切得酶切得5 kb片段片段, 用用E2酶切得酶切得3 kb片段片段.     YIp载载体体和和杂杂交交示示意意图图载载体体的的整整合合和和重重组组 4.  YRp载体载体       1）酵母染色体复制子和）酵母染色体复制子和ARS的保守性的保守性                酵母染色体总长为酵母染色体总长为15,000 kb,根据电镜观察结果预计有根据电镜观察结果预计有400个复制起点，根据基因克隆分离个复制起点，根据基因克隆分离ARS的实验结果估计有的实验结果估计有480个个ARS。

       2））YRp的特点的特点             i. 高频转化高频转化           ii.  转化子不稳定转化子不稳定           iii. 子代细胞质粒分散不均匀子代细胞质粒分散不均匀           iv. 从酵母转化体中可分离到与转化前相同的质粒从酵母转化体中可分离到与转化前相同的质粒DNA            v. 可整合到染色体中去，与可整合到染色体中去，与YIp整合过程相同整合过程相同       YRp载体和杂交示意图载体和杂交示意图1-YRp12 探针探针; 2-URA3探针探针;  3-ARS探针探针;  4-pBR322探针探针假设宿主菌染色体的假设宿主菌染色体的ura3基因酶切得基因酶切得3 kb片段片段, 而而ARS片段片段酶切得酶切得1 kb片段片段. 3））YARp载体（酵母非着丝粒复制质粒）载体（酵母非着丝粒复制质粒）          1.4 kb酵母酵母DNA（（EcoRI片段）自我连接而成，该质粒含有片段）自我连接而成，该质粒含有ARS1和和TRP1基因基因   该质粒特点该质粒特点:            i.  高拷贝高拷贝,100-200/cell;            ii. 比比YRp 质粒稳定质粒稳定;          iii. 可形成核小体可形成核小体;          iv.  减数分裂以减数分裂以4+:10分离分离YAR质粒的结构质粒的结构5.  YEp载体载体     1) 酵母酵母2μ质粒质粒         i. 结构结构 ii. 结构特点结构特点 2μμ质粒的结构质粒的结构 2μ质粒倒置区的质粒倒置区的同向和反向重复片段同向和反向重复片段2））2μ质粒载体质粒载体     YIp中可插入整个或部分中可插入整个或部分2μ质粒质粒DNA构成构成YEp。

大多数酿酒酵大多数酿酒酵母菌株中都含有母菌株中都含有2μ质粒，质粒，YEp复制所需的酶可由复制所需的酶可由2μ质粒提供质粒提供     YEp具有具有YRp载体相同的特点，它还可以与载体相同的特点，它还可以与2μ质粒发生重组质粒发生重组重组质粒不稳定，在无选择压力条件下可很快消失利用此特点重组质粒不稳定，在无选择压力条件下可很快消失利用此特点可除去酵母菌株中的天然质粒，即可除去酵母菌株中的天然质粒，即[Cir+]   [Ciro]     当当YEp进入宿主细胞后，其转化体内所含进入宿主细胞后，其转化体内所含DNA可得如下杂交图可得如下杂交图谱（设谱（设YEp为为8 kb，，BamHI有一单切点）有一单切点）1-YEp13 探针探针; 2-2μ质粒探针质粒探针;  3-LEU2探针探针;  4-pBR322探针探针6. YCp载体载体      第一个着丝粒于第一个着丝粒于1980年分离自第三染色体年分离自第三染色体, 现已从酿酒酵现已从酿酒酵母菌中分离到多个着丝粒母菌中分离到多个着丝粒, 它们具有如下保守序列它们具有如下保守序列:     足迹分析技术表明足迹分析技术表明,着丝粒中有一个着丝粒中有一个200-250 bp的免受核的免受核酸酶作用的酸酶作用的DNA序列序列, 可分为四个区。

各着丝粒间不发生交可分为四个区各着丝粒间不发生交叉杂交YCp载体结构载体结构 7. YLp载体载体      真核细胞染色体的末端有两个独特的性质：能使染色体保持真核细胞染色体的末端有两个独特的性质：能使染色体保持稳定，能成功地进行稳定，能成功地进行DNA复制这种末端复制这种末端DNA称之为端粒端称之为端粒端粒结构与染色体其余部分的结构是不同的人为诱发的染色体粒结构与染色体其余部分的结构是不同的人为诱发的染色体断裂很不稳定，如果不能修复，将是致死的环状质粒经限制断裂很不稳定，如果不能修复，将是致死的环状质粒经限制酶切后的末端极不稳定，极易发生重组，或发生降解，或发生酶切后的末端极不稳定，极易发生重组，或发生降解，或发生重新环化重新环化      最先用于构建最先用于构建YLp的端粒来自四膜虫的核糖体的端粒来自四膜虫的核糖体DNA，不同长，不同长度的度的YLp具有不同的特点具有不同的特点8. pYAC载体载体                   酵母菌人工染色体酵母菌人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建, 由由YLp经适当经适当改造后构建成改造后构建成pYAC载体。

载体pYAC载体具有以下特点：载体具有以下特点：        1）） 双双TEL位点；位点；       2）） 三个酵母菌遗传标记基因；三个酵母菌遗传标记基因；        3）） 一个一个SUP4基因用于检测重组子基因用于检测重组子，其原理是：，其原理是：SUP4是是tRNAtyr的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的ade2赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在SUP4基因基因中插入外源中插入外源DNA片段后在转化片段后在转化ade2宿主菌，转化子成红色宿主菌，转化子成红色菌落pYAC载体的结构载体的结构 9. 酵母杂交系统载体酵母杂交系统载体       主要用于研究主要用于研究DNA-蛋白质和蛋白质蛋白质和蛋白质-蛋白质之间的相互作蛋白质之间的相互作用，可用于新基因的克隆该类载体可分为两类：用，可用于新基因的克隆该类载体可分为两类：        一类载体中存在一个一类载体中存在一个DNA-结合序列结合序列(BD)，它与已知的钓，它与已知的钓饵序列融合；另一类载体则含有基因表达激活序列（饵序列融合；另一类载体则含有基因表达激活序列（AD），），它则与未知或已知的捕猎序列融合。

它则与未知或已知的捕猎序列融合      单杂交系统载体单杂交系统载体       双杂交系统载体双杂交系统载体      三杂交系统载体三杂交系统载体 除上述普通型的各类载体外，还有其它不同功能的载体：除上述普通型的各类载体外，还有其它不同功能的载体：  表达型表达型—yeast expression plasmid;     启动子探针型启动子探针型—yeast promoter plasmid, YPp;  杂合型杂合型—yeast hybrid plasmid, YHp,与阅读框架探针型相同与阅读框架探针型相同双杂交系统和载体双杂交系统和载体二、丝状真菌克隆载体二、丝状真菌克隆载体  1.丝状真菌的特点丝状真菌的特点         1）） 属低等真核生物，结构简单，易于培养属低等真核生物，结构简单，易于培养        2）） 基因结构与高等真核生物的基因结构具较大相似性，基因结构与高等真核生物的基因结构具较大相似性，如内含子数目、位置等如内含子数目、位置等        3）） 用于生产某些具生物活性的基因产物更具吸引力，用于生产某些具生物活性的基因产物更具吸引力，如糖基化、蛋白质外泌如糖基化、蛋白质外泌        4）） 有些丝状真菌的的遗传背景较为清楚有些丝状真菌的的遗传背景较为清楚  2. 丝状真菌克隆载体丝状真菌克隆载体          1）） 自主复制载体自主复制载体，其复制起点来源于以下三类，其复制起点来源于以下三类DNA：：               i. 线粒体质粒，如来自间型脉孢菌线粒体质粒，如来自间型脉孢菌(N.intermedia)线粒体质粒线粒体质粒: pBR322+线粒体质粒线粒体质粒+qa-2+      pALS1        转化粗糙脉孢菌转化粗糙脉孢菌       pALS2（高频转化小质粒）（高频转化小质粒）     ii. 类质粒（类质粒（plasmid-like)，如由柄孢壳，如由柄孢壳(Fedospora auseniw)的类质粒的类质粒(2539bp)所构建的克隆载体可达所构建的克隆载体可达1000-9000/μg的转化率，可重新分离，无重组发生，其复制起的转化率，可重新分离，无重组发生，其复制起点序列与酵母和海拉细胞线粒体质粒复制子序列相同。

点序列与酵母和海拉细胞线粒体质粒复制子序列相同    iii. 染色体复制子染色体复制子      ⅰ)构巢曲霉（构巢曲霉（A.nidulans)复制子复制子       pILJ16(5.4kb)+AMA1(6.1kb)         ARp1(4.5kb)            转化频率转化频率20,000/106原生质体原生质体·250ngDNA，可在黑曲霉，可在黑曲霉(A.niger)和米曲霉和米曲霉(A.oryzae)以相同转化频率转化以相同转化频率转化10-30 copies/单倍体基因组单倍体基因组       ⅱ)玉米黑粉菌玉米黑粉菌(Ustilago maydis)复制子复制子            9×104 /ng DNA，，25 copies/cell      2）整合型载体）整合型载体             由由E.coli克隆载体加上一适合于丝状真菌的标记基因克隆载体加上一适合于丝状真菌的标记基因构成，转化频率构成，转化频率1-10/μg DNA       3）标记基因）标记基因 amds— amds—乙酰胺酶，乙酰胺酶，dir—dir—线粒体线粒体ATPATP合成酶，合成酶，qa-2-qa-2-分分解奎尼酸脱氢酶，解奎尼酸脱氢酶，acuD—acuD—异柠檬酸裂解酶，异柠檬酸裂解酶，HgyHgyr r——潮霉潮霉素抗性。