凝胶过滤法分离蛋白质.ppt
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实验三 凝胶过滤法分离蛋白质血红蛋白+高铁氰化钾 高铁血红蛋白 Mw=64 500 Mw=327.25 黄色(过量) 红褐色实验原理凝胶过滤法(分子筛层析/凝胶层析):凝胶——多孔凝胶颗粒(分子筛)： 交联葡聚糖凝胶 (Sephadex G-25 )PBS大分子不能进入凝胶颗粒内部 ，直接沿凝胶颗粒间隙流出， 流程短，故先洗脱出来;小分子则扩散进入凝胶微孔， 流程长，在柱内保留时间长， 则后洗脱出来凝胶过滤法的分子筛效应G-25凝胶颗粒大分子小分子大分子凝胶颗粒小分子操作步骤v凝胶准备（已完成）v装柱（关开关）v样品处理 (3滴+8滴+2滴，已完成 ) v上样(开关，加样0.2ml，开)v洗脱(3cm)v分部收集（10滴/min, 13滴/管）v测定A425(+2ml蒸馏水，空白管)1.装柱后 及洗脱时2.上样时柱床PBS (3cm)PBS (1mm)管编号A4251 2 3 4 5 6 7 8 9 10洗脱图谱MetHb K3Fe(CN)61. 装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层 的界面时，需要重新装柱。
2. 上样时滴管末端一定要靠近凝胶柱表面(1cm)、 沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面样 品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层3. 收集要及时，不能等红褐色物质流出之后再收 集(13滴/管)4. 流速不可太快(约10滴/min) 5. 洗脱过程中要防止凝胶柱洗脱液流干(3cm)6. 洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃注意事项思考题v若洗脱图谱只出现一个峰，试分析可能的 原因。
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