蛋白质分离纯化实验报告模板.docx

高级生物与分子生物学实验报告姓名： 学号：指导老师实验一：重组pGEX-X载体的构建及表达【实验原理】：1. DNA连接原理：本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼 脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用 T4 DNA 连接酶连接表达融合蛋白的重组质粒2. 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：经氯化钙处理的大肠 杆菌，受短暂的热刺激后，可形成易于接受环状质粒 DNA 的感受 态细胞由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因(本实验 质粒带有卡那霉素抗性基因)，根据转化菌的耐药特性进行删选3. 裂解法小量制备质粒DNA的原理：SDS和NaOH使蛋白质和染色体DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存在于上清液中；乙醇可使质粒 DNA 沉淀，酚、氯仿去除残留的 蛋白质4. 重组质粒鉴定的原理：对所有的重组质粒用限制性内切酶酶切， 酶切产物行凝胶电泳以鉴定质粒 DNA5. 组质粒的诱导表达的原理：Ptac启动子受lac阻遏物所调控，该 启动子需要加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)进行诱导°IPTP的终 浓度为 1mmol/L6. 融合蛋白的表达检测的原理 ：经诱导表达的重组体裂解后，经SDS-PAGE 鉴定。

染色后明显出现目的蛋白带，而未经诱导的菌无此蛋白带实验步骤】：1. 配制LB和LK培养基2. 连接：质粒片断+目的基因（1.5ml离心管），16°C水浴过夜，65°C水浴10min,灭火连接酶ddH2O12ulX-DNA（目的基因）3ulpET-28a （质粒片断）2ul10Xbuffer2ulT4 ligase1ul3. 复苏DH5a和BL21,并接种DH5a 1支，接种BL21 1支（10ul菌液+2ml LB）于试管，第二天7： 30分别转接DH5a和BL21 （1ml+20mlLB ）于烧瓶分别准备制备感受态，两个连接反应用 来转化）4. DH5a和BL21感受态细胞的制备：在烧瓶孵育2.5h后，取1.5ml菌液至 1.5ml 离心管，4000rmp，5min，弃上清，加 500ul 100mmol/l CaCl ，混匀，离心 4000rmp, 5min，弃上清，加 500ul 100mmol/l2CaCl，混匀，冰浴 30min，离心（4°C，4000rmp， 5min），弃上2清加100ul 100mmol/l CaCl，重新悬浮沉淀25. 转化：另取1.5ml离心管，加连接反应液20ul，再加50ul DH5a和BL21感受态细菌，混匀，冰浴30min。

42C水浴90s，再冰浴1-2min加 500ulLB, 37°C摇床培养 lh5000rpm,离心 3 分钟 倒上清，重悬沉淀6. 涂板，37度过夜培养（DH5 a：感受态一块LB,感受态一块LK转化菌一块LK, BL21同样）7. 检查细菌生长情况，只有转化菌才能在含卡那霉素的培养基生长 6密集^ rT22?\ 密集生长I 丿 \ I无细菌生长 J丿 I 均匀分布 ,8. 质粒提取-碱裂解法1. 占菌液I离心” SOOOrpm. 3分帥 弃上清（充分）沉淀，力附0加I溶液£|充分混匀’冰上吕分钟力Q200UI溶液I I瓢倒混匀〔轻柔）I冰上弓分钟力日15加1；容液丨II|颇倒混勻，冰上5分聊［鬲心’ 仙00中分钟巾枪吸40 Ou E上清至新管加1m I无水乙醇！混匀t 冰上5-10分钟沉淀,加入1憎1 了 0%酒精|离心，1200rpm, 5分钟 弃上清| 1200rpm瞬时离心用枪呱取残金液体|幵盖’晾5/0分钟沉淀，加20uSTE+1ulRP4Aase离心，12000ipm, 10分钟9. 质粒酶切反应：在1.5ml离心管中加入以下物质，充分混匀后，瞬时离心，37度保温1-2小时单酶切（ul）双酶切（ul）ddH20141310xbuffer2ul2质粒3ul3BamH I11Xho I/1Total202010. 琼脂糖凝胶电泳：溶胶（用TAE缓冲液，充分融化），稍冷却后 倒胶，加样（样品要加样品缓冲液至lx），电泳（1-10V/CM），染色 与观察拍照。

11. 蛋白诱导表达：（BL21）亦i过夜培养菌液转孩1旳至30m埠养基爪血1 r孙度炭荡培养3小时I tolPTG 至取样51至1.5ml离心管37度震荡培养1小时1取样Q.涮至1r1,亦）离心管37度震荡培亦2小时I1取样0.亦［至1.藹心管12.SDS-PAGE 过程①配胶制备分离胶(12%)制备浓缩胶(5%)dH20：3.3ml30%丙烯酷胺’4.0mltOM Tris-CI(pH8.8)：2.5m110%SDS：OJml10%过硫酸镀：0.1 mlTEMED：0.005 ml②样品制备dH20；3.4ml30%丙烯酰胺主O.BSmll1MTris-CI(pF45. 8):0.625m110%SDS：0.05ml!忆％过硫酸饕0.06ml!TEMED：0.005ml莹液|离心，4000^171, 5分钟弃上清再120Croni瞬时養心I用枪吸去上清’加50u I重悬沉淀［加入50ul 2xSDS样品缓冲液混匀后至沸水浴中煮45分钟4度或-20度保存③ 加样④ 电泳(200V)⑤ 染色：考马斯亮蓝染色或银染【实验结果】重组质粒的鉴定空双单质M双单质【实验分析】⑴在重组质粒酶切鉴定图谱中，第一加样泳道为DNA marker,接下 来的三泳道依次为：没有经过酶切的重组质粒加样泳道，双酶切的重 组质粒加样泳道，单酶切的重组质粒加样泳道。

经过分析，经单酶切 的重组质粒两片段的分子量大小分别符合载体pET28a ( + )和目的基 因X的大小，即重组质粒构建基本成功但是，每一泳道都有拖尾， 这可能是酶切时间过短，使酶切不彻底，也可能是限制性内切酶活性 不高，未放于冰上，使其酶切效果不佳也有可能是胶制作不理想或 者电解液不纯所造成总之，能引起跑胶拖尾的原因很多，必须每一 步都正规操作，尽量防止这种情况的出现⑵在不同时间间隔IPTG诱导重组质粒表达蛋白图中，从左边起的第 一至第三泳道分别是时间间隔为0h,lh,2h重组质粒经异丙基硫代半 乳糖苷(IPTP)诱导在BL-21细胞中蛋白表达后用考马斯亮蓝染色的 图示，可以看出蛋白表达量依次增多实验二：脲酶的分离纯化及比活性测定实验仪器、试剂】：仪器：层析柱耳1.2cmX20cm恒温水浴箱751或者752紫外分光光度计721分光度计试剂：1、3%尿素2、 0.1mol/L pH6. 8的磷酸盐缓冲液3、 1mol/L HCl4、32%丙酮溶液5、纳氏试剂6、O.OOlmol/L标准硫酸铵溶液【实验原理】： 蛋白质（酶）是非常重要的生物大分子，其性质差异很大蛋 白质的分离和提纯工作室一项艰巨而又复杂的任务。

到目前为止，还 没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混 合物中提取出来，但对于任何一种蛋白质都可能选择一套适当的分离 提纯程序来获取高纯度的制品脲酶分子量较大，达490kD当脲酶粗制品通过交联葡聚糖SephadexG-200 层析柱时，此酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内而 其它小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒，因此， 用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与 其他物质分离的目的定时或定量收集洗脱液，分别在752 分光光度 计 282nm 波长测定其吸光度，再分别测定洗脱峰内各管的酶活性， 以酶活性为纵坐标，以管号为横坐标，会出酶活性曲线，酶活性与蛋 白质洗脱曲线中峰值重叠的部分即为分离所得到的脲酶所在部位酶活性测定系根据酶催化尿素水解释出氨和co2作用CO(NH2)^ + h2o• 2NHa + CO2反应2NH4OH + 2(Hgl2-2KI) + 3NaOHv '奈氏试剂ZH\+ O NHJ ■+ 4KI + 3Nal + 3H?O硫代双隶氨〔黄色)聯酶活性高 主成氨就多 *黄色亦深【实验步骤】1. 制备脲酶粗提液称0 5克黄豆粉于小三角瓶中I抑2.5ml32%丙酮！靂荡10miri亠I离心3000转，10分钟I上清液转至新离心管，加4倍体积冷丙酮I离心3000转，5分钟I沉淀，待丙酮挥发了 加1靳1蒸谓水溶解离心3000转，10分钟I上清/粗提液2. 凝胶过滤层析① 装柱：保持竖直，防分层、干裂② 平衡：装好后用蒸馏水平衡③ 加样：加0.6ml粗提液④ 洗脱与收集：用蒸馏水洗脱，3ml/15分钟/管，收集12管3. 蛋白质含量检测4. 蛋白质活性检测【实验结果】：1. 硫酸铵标准曲线绘制管号试剂12345670.001M 硫酸铵(ml)0.10.20.30.40.50.6-含NH3的微克分子数0.20.40.60.811.2-H2O(ml)2.92.82.72.62.52.43混 匀奈氏试剂0.75ml,立即混匀A4800.5481.0481.5751.8342.4242.86202.蛋白含量测定：3.酶促反应：释）3%尿素(ml)0.50.50.50.5).50.50.5).5 ().5).50.1M PBS1.01.01.01.0L.01.01.0L0 :.01.037度保温15分钟酶液—0.50.50.5).50.50.5).5 ().5).5H2O0.5混匀，37度保温15分钟向各管加入1M HCl 0.5ml,放置5分钟，加1M NaOH 0.5ml终止反应4. 显色与测定5. 酶活性计算［单位：NH3(umol)数/mL［洗脱液・h］蛋白浓度(mg/ml) =A280x0.75活性/ml洗脱液=NH3(umol)数x3.0/取酶促反应液ml数xl/0.5x60/15 活性/管=活性/ml洗脱液x 3比活性 =每毫升洗脱液的活性/每毫升洗脱液的蛋白含量酶活性图实验分析】：由图可知：酶活性与蛋白质洗脱曲线中峰值重叠的部分在第三管 或者第四管，即脲酶所在部位为第三或者第四管。

实验过程中，显色 反应是第四管黄色最深最明显，由此可知，第四管的脲酶活性最大 但是，酶的比活性却是第十一管最高这可能是酶蛋白含量的差距比 酶活性的差异大的多，所造成的结果。