蒽酮比色法测糖.doc.docx

蒽酮比色法测糖 一　目的　掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法 二　原理　蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收 本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量　 三　实验器材及试剂 马铃薯干粉、 可调试移液器或移液管 、可见分光光度计（723型）、电子分析天平 、水浴锅 、电炉子 蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用 标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用葡萄糖标准溶液：称取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg，配制成500ml溶液，即得每ml含糖为200μg的标准溶液 蒽酮试剂：称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000ml稀硫酸中即得硫酸溶液由760ml浓硫酸（比重1.84)稀释成1000ml而成2g/L蒽酮试剂：溶解2g蒽酮于1L浓硫酸（98%的浓硫酸）中，当日配制使用 四、操作 1．可溶性糖的提取 　　称取重约5g的新鲜植物叶子，于研钵中乙醚少许，仔细研磨成均匀的浆状物，倒入烧杯中，用70℃热水洗涤研钵，洗液并入烧杯中，再加蒸镏水30─40ml。

将烧杯放在水浴锅中加热，保持温度70─80℃约半小时，冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅，以除去蛋白质，直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振荡以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中，瓶中事先放有少量（约0.2─0.4g）草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再行过滤，所得的透明滤液即为可溶性糖提取液 2．显色及比色 　 吸取上述糖提取液1ml，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度从标准曲线上查得滤液中的糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数 3．绘制标准曲线 　　准确称取0.1g葡萄糖（分析纯），溶解并用蒸馏水定容至100ml后，分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中，并用蒸馏水定容到50ml，配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中，再加入3ml的蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待几支试管均匀加完后，一起浸入100℃恒温水浴箱中，为防止水分蒸发，应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子，自温度重新升至100℃起计时，准确保温10min后取出，用流动水冷却，然后，于室温中平衡片刻（约10min左右），在分光光度计上，波长620nm处，用0.5cm厚度的比色杯，以空白管做对照空白（此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂，其他反应条件都一致），进行比色。

既得标准曲线 　如下表格 　　 编号123456体积ml012345浓度ug/ml0204060801002.样品含量的测定　　　 样品液的制作： 精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出， 3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中 样品液的测定： （1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却） （2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值 （3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量 3．结果计算： CV w=————100% m， 式中w：糖的质量分数（%） C：从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml） V：样品稀释后的体积（ml） m：样品的质量（ml）注意事项： 　　1.一定要注意温度要控制在100℃ 　　2.从100℃开始准确计时10min,然后迅速冷却，于室温中平衡10min. 　　3.蒽酮要注意避光保存。

配置好的蒽酮试剂也应注意避光，当天配制好的当天使用 4.试管要保证干燥清洁，无残留水滴精美排版。