细胞迁移和侵袭实验资料.pdf

1 - 4 细胞迁移和侵袭实验细胞迁移和侵袭实验 实验准备：实验准备： 细胞，24 孔板，transwell 小室（8µm，24 孔板专用） ，ECM Gel，10%FBS+ 培养基， 无血清培养基， 10 µ、 200 µL、 1000 µL 移液器及配套枪头， 1.5 mL EP 管，冰盒 实验实验设计：设计： 实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素） ，实验组（按照实验需 要，上层或者下层加入趋化因素） ，对照组（趋化因素与实验组中的相反） 如果 有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素） 实验操作实验操作（请细读注意事项）（请细读注意事项） ：： 一、细胞侵袭实验 1. ECM Gel 原液提前 1 h 放在 4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中 2. 将 1.5 mL EP、枪头盒、transwell 放在 24 孔板里面后，置于冰上预冷 3. 根据自己的使用量，按照 ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5 在冰上稀释成使 用液 4. 把枪头剪去一小段（约 3 µm）后在冰上吸取 40 µL/孔 ECM Gel 使用液轻轻 加入 transwell 上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。

5. 放在 37 ℃孵箱 15 min，让胶凝固 6. 消化、离心、计数细胞后，按照 2.5x104 / mL 用无血清培养基稀释细胞， 制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在 4、5 之前做） 7. 按照每孔 200 µL， 将细胞悬液加入 transwell 上室， 同时在 transwell 下室加 入 10%FBS+培养基 500 µL，放入 37 ℃孵箱培养 8. 若干小时后取出，吸去 transwell 上室多余液体，用 PBS 清洗两次，用棉棒 在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞 9. 在上室中加入结晶紫染液，染色 5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液， 再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分 10. 在正置显微镜上放置一块载玻片，将 transwell 小孔倒置放在上面，拍照 11. 在 100 倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数 2 - 4 12. 清洗 transwell，可以反复使用 二、细胞侵袭实验 细胞迁移实验不需要 ECM Gel 包被，其余步骤一致 实验原理：实验原理： 多孔膜是聚碳酸酯膜 （polycarbonate membrane） ，膜带有 微孔，孔径大小有 0.1－12.0 µm。

将 Transwell 小室放入对应的培养 板中，小室内称上室，培养板内称下 室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯 膜相隔将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可 以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等 的影响 细胞迁移和侵袭实验常用 8.0µm 膜， 上室种肿瘤细胞， 下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养 成分高的下室运动，从而从多孔膜一侧穿过，贴壁于多孔 膜的另一侧，计数其细胞量可反映肿瘤细胞的迁移或者侵 袭能力（圆形透明小孔为微孔） （注：迁移和侵袭是两个概念，迁移是指细胞的运动能力，而侵袭是细胞在运动 的同时会分泌出消化 ECM 的蛋白，清除运动障碍，这个实验更能模拟人体内环 境） 注意事项注意事项 1. ECM Gel（货号：E1270）由 Sigma 公司生产，来源于大鼠肉瘤的细胞外基 质提取物，保存在-20℃，由于在室温中会快速凝固，不可逆，因此需要在 冰上溶解和操作，同时一切要与 ECM Gel 接触的耗材也需要预冷，避免俩 3 - 4 者接触时温差较大引起 ECM Gel 凝固粘附，造成浪费。

2. 本组常用的 Transwell 是 Millipore 公司生产 的 8um 悬挂式 millicell（货号：Millipore PIEP12R48 Millicell Hanging Cell Culture 24 well PET 8um） 每次使用完后用 0.25%胰酶 浸泡膜底 10 min 去除贴底细胞，清洗，棉 签温柔擦拭， 75%乙醇浸泡 24h，晾干， 使膜上粘附的细胞和染液完全洗脱，下次使用前紫外照射正反两面，各 30 min，通常可以反复用 3-5 次 3. 制作 ECM Gel 使用液时，先加入培养基，再加入 ECM Gel；同时在使用量 的基础上多配置 5-20 uL（使用量多就多配点） ，避免液体挂壁造成最后一 次加样不够 4. 加胶时，胶的量以刚好把胶浸湿为最好（24 孔的 millicell 需要 35-40uL） ， 过厚细胞侵袭变慢，过少则失去侵袭实验的意义；完成后可轻轻地，均匀 地拍打培养板四个侧面，让液体完全平铺，这样可以避免因为胶的厚薄不 均而引起的误差 5. 凝固时间可以适当延长，但最好不要超过 30min，防止液体挥发使 gel 凝 固得过硬。

6. 通常先根据细胞的侵袭能力估计每孔小室加入的细胞数量，侵袭能力强的 细胞 （如231， CAF） 每孔加入5,000个， 那最后的细胞悬液应该制备成2.5x104 / mL，而侵袭能力弱的细胞（如 MCF-7）可以提高细胞数量，达到 10,000 个，那最后的细胞悬液应该制备成 5x104 / mL上层加入细胞悬液后可轻 轻地，均匀地拍打培养板四个侧面，让液体完全平铺，避免细胞分布不均 而引起细胞计数时中间多两边少 7. 加入下室中的 10%FBS 是作为趋化因子诱导细胞运动，24 孔板下室一般加 入 500µl 含 FBS 的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考 说明书这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一 旦产生气泡，气泡处的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别 留心，小室在放入时倾斜缓慢放入（注意小室中的液体不要流出） ，可以 4 - 4 避免气泡培养时间需要自己根据文献做预实验，寻找合适的时间点；时 间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，细胞数及处理因素对细胞数 目的影响也不可忽视，穿过的细胞数在 100-200 之间最好棉签清洗时一 定要轻柔，防止戳破多孔膜。

8. 结晶紫是细胞核染液，细胞大小不同，染色时间也有改变，染液放置的时 间和浓度也会对染色时间有影响，需要自己掌握；最优的染色状态是细胞 核颜色深，胞浆色浅。