酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定.ppt

酶促反应动力学 实验影响酶促反应速度的因素酶促反 应速度C CF FD DE EA A底物 浓度酶浓度pH值抑制剂激活剂B B温度酶浓度对反应速度的影响正比例 关系底物浓度 >酶浓度酶被底物 饱和温度对反应速度的影响v一方面是温度升高, 酶促反应速度加快 v另一方面,温度升高 ,酶的高级结构将发生 变化或变性，导致酶 活性降低甚至丧失 v在最适温度条件下, 反应速度最大pH 对反应速度的影响v在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称 此pH 为最适 pH激活剂对反应速度的影响必需激活剂， 大多为金属离 子，Mg2＋，K＋ ，Mn2＋，等酶的激活剂非必需激 活剂抑制剂通常以非 共价键与酶或酶 -底物复合物可 逆性结合，使酶 活性降低或消失 抑制剂通常以共 价键与酶活性中 心或活性中心以 外的必需基团相 结合，使酶失活 不可逆性 抑制作用可逆性抑 制作用抑制剂对反应速度的影响竞争性竞争性非竞争非竞争 性性反竞争反竞争 性性Km, Vmax降低竞争性竞争性非竞争非竞争 性性反竞争反竞争 性性Vmax降低竞争 性非竞 争性反竞 争性Km增大可逆性抑制作用底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度底物浓度 的增高的增高高低反应速度和底物浓 度成正比关系酶活性中心被底物饱和反应速度增幅下降单底物、单产物反应酶促反应速率一般在规定反应条 件下，用单位时间内底物的消耗 量或产物的生成量来表示。

反应速率取其初速率，即底物的消 耗量很小(≤5%)时的反应速率底物浓度远远大于酶浓度研究前提矩形双曲线 nKm 即为米氏常数，nVmax为最大反应速 度n当反应速度等于最大速度 一半时,即V = 1/2 Vmax, Km = [S] n上式表示,米氏常数是反 应速度为最大值的一半时的 底物浓度n因此,米氏常数的单位为 mol/L米－曼氏方程式米氏常数Km的意义v不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重 要的特征物理常数vKm值只是在固定的底物，一定的温度和 pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不 同条件下具有不同的Km值vKm值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值 大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值 小表示亲和程度大,酶的催化活性高 Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比意义：Vmax=K3 [E]如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3米氏常数的求法1V=KmVmax×[S]11 +VmaxV表示酶促反应速度Vmax表示酶促反应最大速度[S]表示底物浓度Km表示米氏常数双倒数作图法底物浓度对酶活性 的影响——碱性磷酸酶Km 值的测定v米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的 常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出Km 的方法。

实验原理磷酸苯二钠碱性磷酸酶H2OpH=10.0， 37℃酚Na2HPO4酚试剂 （磷钼钨酸 ）OH－蓝色化合物650nm吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度以吸 光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐 标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值v1．酚试剂v2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 v3．碱性缓冲液(pH-10.0)v4．碱性磷酸酶液试剂试剂(ml)12345678 2.5mM磷酸苯二 钠0.20.30.40.50.60.81.01.0蒸馏水0.80.70.60.50.40.2--碱性缓冲液1.01.01.01.01.01.01.01.0混匀后，370C水浴 5 min 碱性磷酸酶液0.10.10.10.10.10.10.1-混匀后，370C水浴 15 min（准确计时） 酚试剂1.01.01.01.01.01.01.01.0碱性磷酸酶液-------0.110％ Na2CO33.03.03.03.03.03.03.03.0操作取8支试管，按下表加入试剂混匀后，37℃水浴15min，以第8管调节零点 ，在650nm波长处进行比色，读取各管A值管号A6501/A650[S]1/[S] 1 2 3 4 5 6 7处理结果以1/A650对1/[s]按Lineweaver-Burk作图法作 图，求出碱性磷酸酶的Kmv 在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合 ，即不能形成EIS，I竞争结合酶活性中心，其动力学特征 是：米氏常数的表观值Km增加，酶的最大反应速度Vm不变 。

v 在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形 成EIS， I结合酶活性中心以外部位，不影响E与S之间的 结合，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特征是： Vm降低而Km不变 v 在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以 后才能和酶结合形成EIS，其动力学特征是；Km和Vm都降 低 v 上述三种抑制类型，可在抑制剂存在下通过动力学特征 图形判断 Lineweaver-Burk Plots of Inhibited Enzymes。