正交试验法研究牛膝中甾酮的水煮提取工艺【药学论文】.doc

药学论文-正交试验法研究牛膝中甾酮的水煮提取工艺作者：王龙，胥秀英，郑一敏，傅善权，易中宏 【关键词】 牛膝摘要: 目的: 研究牛膝中甾酮的水煮提取工艺与含量测定方法 方法: 采用正交实验，筛选牛膝中甾酮的最佳水煮提取条件;用高效液相色谱法对提取物中蜕皮甾酮的含量进行测定 结果: 牛膝中甾酮的最佳水煮提取条件为共加入50 倍量水，在 80～100℃下提取 2 次，2h/次;以蜕皮甾酮对照品色谱峰面积 y对其含量 x 进行回归统计，线性回归方程为:y=1.02751×106 X+158195，r=0.9996，线性范围为 0.406～7.308μg 结论: 水煮提取工艺得到牛膝提取物中蜕皮甾酮的含量为 9.30%;高效液相色谱法适合于牛膝提取物中蜕皮甾酮含量的测定 关键词: 牛膝; 甾酮; 提取; 含量测定Optimization of water extracting conditions of phytosterone from Achyranthes bidentata by orthogonal testAbstract: Objective:To study the water extracting process and content determination of phytosterone from A.bidentata.Methods:Screened the optimum extraction condition with the orthogonal test and determined the content of ecdysterone with HPLC.Results:The best extraction condition was as follows:adding50times amount of water and boiling on80～100℃for2times in all，2h each time.The ecdysterone linear range was0.406～7.308μg，r=0.9996.Conclusion:The content of ecdysterone in the extract is9.30%.HPLC method is suitable for the determination of ecdysterone. Key words: A.bidentata; Phytosterone; Extraction; Content determination 牛膝为苋科植物牛膝 Achyranthes bidentata BI.的干燥根，主产河南，具有补肝肾，强筋骨，活血通经的作用。

甾酮是牛膝有效成分之一牛膝中甾酮有蜕皮甾酮，牛膝甾酮，红苋甾酮等［1］ 文献报道牛膝甾酮提取分离有乙醇回流 ［2～4］ 、甲醇回流［5］ 等方法，本文对牛膝中甾酮的水煮提取工艺和含量测定方法进行了研究，现报道如下 1 材料与仪器供试药材购于重庆桐君阁医药公司，经重庆市中药研究院傅善权副主任技师鉴定，为怀牛膝 A.bidentata 的干燥根;蜕皮甾酮对照品（由本实验室自制，纯度为 99.2%，批号 030516）;大孔吸附树脂（天津制胶厂）;甲醇为分析纯;水为重蒸水;其它试剂均为分析纯;日本岛津 LC-10A 型高效液相色谱仪 2 方法与结果2.1 正交实验设计 预试研究结果表明，采用水煮提取工艺，可取得较高的提取转移率，与用有机溶剂比较，具有成本低的特点考虑到用水量、提取温度、提取次数和提取时间是水煮法提取牛膝中甾酮的重要影响因素，其中用水量对后续甾酮的分离提取过程影响较大，故作为重点考察因素，设置了 6 个水平，其它两个因素设置了 2 个水平因此，选用 L12 （6×22 ）不等水平正交试验表安排试验表 1 正交试验因素水平表（略）称取牛膝药材适量，按上述正交实验条件进行处理，每组合重复 3 次。

煮提液过滤后，滤液通过大孔吸附树脂柱，吸附完毕后，用 85%乙醇溶液 60ml 洗脱，洗脱液于 80℃烘干至恒重，得到牛膝提取物2.2 HPLC 法测定蜕皮甾酮含量2.2.1 对照品溶液的制备 　　精密称取干燥至恒重的蜕皮甾酮对照品，用体积分数 60%甲醇溶解制成0.406mg/ml 溶液，作为对照品溶液2.2.2 样品溶液的制备 精密称取牛膝提取物适量，用 60%甲醇制成 5mg/ml的溶液，0.45μm 滤膜滤过，滤液作为供试样品溶液2.2.3 色谱条件 参考文献［2～6］ 并经过筛选试验，确定最佳色谱条件为:迪马Phenomenex LUNA C18 柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相甲醇-水（50:50），流速 0.8ml/min，检测波长 243nm，柱温为室温 t/mint/min2.2.4 标准曲线的制备和方法学考察 精密吸取 0.406mg/ml 蜕皮甾酮对照品溶液分别进样1，6，14，16，18μl，测定峰面积以蜕皮甾酮对照品峰面积 y 对其含量 x 进行线性回归，得线性方程为:y=1.02751×106 x+158195，r=0.9996，蜕皮甾酮线性范围为 0.406～7.308μg。

经方法学考察，在 16h 内，样品稳定性 RSD 为2.17%，仪器精密度 RSD 为 1.32%，样品重现性 RSD 为 2.25%，平均回收率为99.5%，RSD 为 1.25%2.2.5 蜕皮甾酮含量的测定 分别精密吸取样品溶液 10μL，按上述色谱条件进样，测定峰面积以标准曲线计算得到正交试验提取物中蜕皮甾酮的含量表 2 不同提取条件下蜕皮甾酮的含量测定结果（略）2.3 方差分析 对表 2 中的甾酮含量这项指标进行方差分析，结果见表 3表 3 试验结果方差分析（略）3 讨论　　3.1 从直观分析的 r 值来看，影响提取物中蜕皮甾酮含量的因素主次顺序为 A>B>C（A 为水量，B 为温度，C 为时间和次数）从方差分析结果来看，A、B 两因素对提取物中蜕皮甾酮含量有显着影响，C 因素影响不显着综合分析，最佳工艺条件为 A6 B2 C1 ，即共加入 50 倍量水，在 80～100℃下提取 2次，2h/次在该工艺条件下，从 100g 牛膝中提取得到 107.2mg 蜕皮甾酮;采用甲醇回流提取工艺，100g 牛膝中提取得到 119.3mg 蜕皮甾酮，两种方法提取率相近，表明水可以代替有机溶剂提取牛膝中的甾酮。

3.2 高效液相色谱法测定牛膝提取物中蜕皮甾酮的含量，方法简单易行，适合牛膝提取物的质量控制 参考文献:［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社，1998:402-409.［2］ 张翠英，梁生旺，张广强.不同产地牛膝中蜕皮甾酮的含量测定［J］.中国中药杂志，2001，36（10）:699-699. ［3］ 国家药典委员会.中国药典.Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社，2000:54-54.［4］ 孟大利，李 铣，熊印华，等.中药牛膝中化学成分的研究［J］.沈阳药科大学学报，2002，19（1）:27-27.［5］ 陈 辛，黎万寿，朱久武，等.RP-HPLC 法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量［J］.药物分析杂志，2000，20（4）:235-235.［6］ 高晓燕，王大为，李发美.牛膝中脱皮甾酮的含量测定及促成骨样细胞增殖活性［J］.药学学报，2000，35（11）:868-868. 。