第六章目的基因的转化资料.ppt

第六章 目的基因的转化,只有获得大量的转基因植株，才能挑选出理想的育种材料目前植物转基因的成功率还很低，存在转化技术复杂、难以规模化操作、及与常规育种结合不紧密等问题，也是植物基因工程产业化的一个瓶颈 目的基因转化首先要建立理想的受体植物感受态系统，其次是建立高效的基因转化系统植物基因转化受体系统的建立 根癌农杆菌Ti质粒基因转化 发根农杆菌Ri质粒基因转化 植物病毒载体介导基因转化 DNA直接导入法基因转化 植物种质系统介导基因转化 植物质体基因转化系统,第一节 植物基因转化受体系统的建立,植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择性抗生素敏感的再生系统一、植物基因转化受体系统的条件,高效稳定的再生能力 较高的遗传稳定性 具有稳定的外植体来源 对选择性抗生素敏感 对农杆菌侵染有敏感性,1.高效稳定的再生能力,用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有良好的实验稳定性和重复性 不同植物的种类、细胞类型、细胞状态、特定的植物培养技术的成熟程度等在建立受体系统时均需考虑 理论上讲，植物的体细胞都具有再生完整植株的潜能，即具有全能型。

但是在组织培养的实践中并不是所有的体细胞都能再生出完整的植株植物细胞的全能性,把具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来，使其处于独立发育的离体条件下； 赋予细胞一定刺激，即营养物质、激素等调控物质培养技术不成熟、深度的分化难以逆转等原因，可造成不能再离体条件下表现全能性只有具备成熟的组织培养条件，保证经外源基因转化的细胞能继续分化成完整植株，才能作为基因转化的受体系统植物基因转化率低，再生频率有不同程度的降低，有的甚至不能再生因此再生系统必须高效，并且具有良好的稳定性和重复性2.较高的遗传稳定性,植物受体系统接受外源DNA后不影响其自身的遗传体系，同时又能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性 组织培养发现体细胞无性系变异非常普遍，而这些变异与组织培养的方法、再生途径及外植体的基因型等都有密切关系 因此，在建立基因转化系统时应充分考虑到这些因素，确保转基因植物的遗传稳定性3.具有稳定的外植体来源,转化的外植体一般采用种子，无菌实生苗的胚轴、子叶或幼叶，可进行离体快速繁殖的材料如一些植物的试管苗，以及可较高频率诱导的营养变态器官等4.对选择性抗生素敏感,抑菌抗生素的条件： 对植物细胞无毒害作用或毒性较小； 有效地抑制细菌生长，特别是农杆菌，例如头孢霉素。

选择性抗生素：淘汰非转化细胞或植株 植物受体材料对所选用的抗生素有一定的敏感性； 抗生素对受体植物没有严重的毒性，不会很快杀死植物细胞，否则转化细胞也难以生活，例如潮霉素，卡那霉素5.对农杆菌侵染有敏感性,对于利用农杆菌Ti或Ri质粒为载体所介导的植物基因转化而言，需要植物受体材料对农杆菌敏感 不同的植物，甚至是同一植物的不同组织细胞对农杆菌侵染的敏感性也有很大差异 因此，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统对农杆菌侵染的敏感性，只有对农杆菌侵染敏感的植物材料才能作为其受体系统植物组织培养转化受体系统,20世纪70年代以来，对植物基因转化受体系统的研究已进行了大量的工作，先后建立了多种有效的受体系统，适应于不同转化方法的要求和不同的转化目的这些受体系统类型各有所长植物非组织培养转化受体系统,,二、植物组织培养转化受体系统,,愈伤组织再生系统,直接分化再生系统,原生质体再生系统,胚状体再生系统,愈伤组织再生系统,外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养或得再生植株的受体系统2.1 植物组织培养转化受体系统类型,特点：,易于接受外源基因，转化率较高； 扩繁量大，可获得较多的转化植株； 外植体试材广泛，多种组织器官均可诱导愈伤组织； 再生植株无性系变异较大，遗传稳定性较差； 嵌合体多； 适用的植物范围广。

直接分化再生系统,外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株特点：,获得再生植株的周期短，操作简单； 可较好维持受体植物的遗传特征； 转化的外源基因能稳定遗传； 再生植株无性系变异较大，遗传稳定性较差； 嵌合体多； 转化频率较低原生质体再生系统,原生质体是“裸露”的植物细胞，能直接高效地摄取外源基因，因而转化效率高且适合于现在建立的所有的转化方法； 原生质体再生系统通常处于相对均匀和稳定的控制环境中，从理论上说，有利于准确的转化和鉴定； 通过原生质体培养，细胞分裂形成基因型一致的细胞克隆，因此再生植株的嵌合体少； 原生质体培养经历许多复杂的生长、发育过程，因此细胞无性系的变异更为强烈，遗传稳定性更差； 原生质体培养周期长、难度大、再生频率低，局限性也较大胚状体再生系统,胚状体是指经体细胞胚发生而形成的形态结构和功能上类似于有性胚的结构，又称为体细胞胚与有性胚一样，在一定条件下可发育成完整的植物体 有些植物本身在自然条件下其珠心组织或助细胞就可自发地形成胚状体 组培过程中，一些体细胞及其单倍体细胞也诱导形成胚状体特点：,胚状体胚性细胞接受外源DNA能力强，是理想的基因转化感受态细胞； 多数为单细胞起源，嵌合体少； 具有两极性，可分化出芽和根，减少生根培养环节； 利用转基因胚状体可以生产人工种子； 个体遗传背景一致、无性系变异小、胚结构完整、成苗快、数量大等，有利于转基因植株的生产和推广； 现今普遍认为胚状体是较理想的基因转化受体系统。

2.2 植物组织培养转化受体系统建立的程序,外植体的选择,选择幼年型的外植体 近根部、茎尖区、生长点区的组织器官一般为幼年型 选择繁殖能力强的外植体 减数分裂前的幼嫩花序和减数分裂后的珠心组织作为外植体是建立高频再生系统及其理想的材料 选择萌动期的外植体 离体培养芽休眠和萌动时间与田间自然条件十分相似，离体培养同样要经过休眠期 选择具有强再生能力基因型的外植体 外植体的再生能力与其基因型有直接关系应对同一植物的不同基因型的外植体进行再生能力筛选 选择遗传稳定性好的外植体 遗传稳定性好的才能将转入的基因以及本身的优良性状保留总体来看，采用胚、幼穗、顶端分生组织、幼叶、幼茎等作为外植体培养基的确立,培养基 的类型,,富集元素平衡培养基：如MS培养基,KNO3含量较高的培养基：如B5、N6、SH,中等无机盐含量培养基：如H、Nitsch、Miller、Blaydes,低无机盐含量培养基：如White、WS、HE、Blaydes,培养基选择原则：,同一物种的培养基有雷同性，不同亚种、品种间基本培养基类型基本相同； 同一植物的不同组织器官的基本培养基类型基本相同； 组培所需营养成分与田间栽培有相似性； MS培养基是大多数植物的通用培养基； 无机盐浓度是基本培养基类型的重要因素，应作为培养基选择的重要参数； 有机成分主要是种类的变化，含量变化不大； 蔗糖浓度不可忽视，应该在确定基本培养基类型后研究最适的蔗糖浓度； 提高磷酸根的水平可以抵消IAA对芽的已知作用，促进芽的分化； 水解酪蛋白能加强激动素诱导分化作用，特别当有高水平的IAA时更为显著。

激素选择原则：,生长素影响茎和节间伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等组培中促进细胞分裂、诱导愈伤组织和生根如IBA、NAA、2,4-D、2,4,5-T； 细胞分裂素促进细胞分裂，改变顶端优势，促进芽的分化等如ZT、BAP、6-BA、2-ip和KT； 细胞分裂素与生长素的比例是激素使用的关键，根据培养的目的进行调节，原则是生长素明显高于细胞分裂素促进细胞脱分化诱导愈伤组织，反之促进细胞分化； 细胞分裂素与生长素种类对不同植物敏感性不同同一植物不同组织在愈伤组织诱导和芽分化过程对激素的要求也不同； 有些植物不能活难以得到芽的分化，可使用一些不常用的激素或激素抑制物，可能启动芽的分化如脱落酸、2,3,5-三碘苯甲酸（0.02 mg/L）、7氮吲哚硝基苯酰溴（0.01-0.1 mg/L）抗生素敏感性试验,受体植物的敏感性试验： 加入对植物细胞无毒害作用的抑菌性抗生素的生长，又不影响植物的正常生长；对植物转化体筛选的抗生素浓度试验，既能有效地抑制非转化细胞的生长，使之缓慢地死亡，又不影响转化细胞的正常生长 设计出愈伤组织诱导或分化再生培养基，加入不同种类不同浓度梯度的抗生素，将未经转化的受体材料置于选择培养基上培养并观察该抗生素对其分化再生的影响。

农杆菌的敏感性试验及菌种的选择,农杆菌载体转化是目前最成功的转化系统，但宿主有一定局限性，即使是同一植物，不同菌株的敏感性也不同因此选择受体植物敏感的菌株是成功转化的重要因素培养野生型农杆菌； 用牙签挑取菌体，穿刺受体植物组织中； 几周后观察肿瘤或发根的诱发情况； 可用带标记（报告）基因农杆菌介导转化2.3 植物组织培养转化受体系统建立的常见问题,植物组织培养的污染问题,污染是组培过程中最主要的问题，对转基因植株的快繁增加了生产成本，造成人力、物力和财力的很大损失灭菌剂：灭菌效果好、对外植体损伤小易洗脱、对环境和实验人员影响小常用乙醇、汞和抗生素；此外紫外和臭氧发生器也应用于组培生产外植体内生菌：内生细菌可以由导管进入到外植体的内部植物组培苗污染的防治措施：,获得优良外植体：采取地点、季节和外植体本身的特性； 物理方法：挖除污染培养基、转移未污染外植体和切除污染外植体； 培养基加入防腐剂山梨酸和苯甲酸或者抗生素等； 滤纸桥瓶外生根法灭菌要彻底各种培养基以及接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌首先是培养基的灭菌，耐高温的培养基需要在121-123℃条件下灭菌20-30min一些不耐高温的物质，可采取细菌过滤器除去其中的微生物。

其次，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染第三，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗 环境消毒尤其是在夏季，高温高湿条件下污染率更高接种和培养环境要保持清洁，定期进行熏蒸或喷雾消毒高锰酸钾和甲醛熏蒸效果好，但对人体有一定的伤害，一般每年熏蒸2-3次平时接种室和培养室可采用紫外线照射消毒或喷2%来苏尔消毒臭氧消毒机对环境消毒效果较好，而且使用灵活方便，对人体的伤害也相对较小 严格无菌操作在接种时要严格无菌操作，避免人为因素造成污染为了使超净工作台有效工作，要定期对过滤器进行清洗和更换每隔一定时间要检测操作区的带菌量，如果发现过滤器失败，则要整块更换试管苗的玻璃化现象,指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象玻璃化苗绝大多数为来自茎尖或茎段培养物的不定芽通常玻璃化苗恢复正常的比例很低，在继代培养中仍然形成玻璃花苗，因此，玻璃化苗是试管苗生产中亟待解决的问题产生机制：,叶片无功能性气孔，由于保卫细胞的功能失调不能关闭气孔，玻璃化的叶片不具有栅栏组织，只有海绵组织。

在茎内有输导组织，但导管和管胞木质化不完全由于玻璃化植株组织畸形，吸收与光合作用功能不全，因而一般不易再回复成正常的试管苗，分化能力降低，难以继代扩繁，更难以移栽成活培养物的褐化,褐变是指在组培过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变褐，培养材料也随之变褐而死亡的现象褐化机理：,三、植物非组织培养转化受体系统,组织培养条件要求较高，仪器设备昂贵，转化率低，操作复杂及有些植物组织培养困难等许多问题制约基因工程发展植物有些组织、器官和细胞同样具有基因转化的条件，再生能力强，分裂旺盛，分化程度低，取材方便，无需组织培养过程，可与常规育种更紧密结合，为非组织培养受体系统3.1 植物生殖细胞受体系统,利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚。