人来源脂肪干细胞的培养.docx

人来源脂肪干细胞的培养1． 脂肪干细胞原代培养1） 取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取），再将脂肪组织一次挤压 进入准备好的15m 1离心管中，每个离心管中的组织不超过5ml2） 吸取缓冲液PBS7m 1加入到上述装有组织的离心管中，用吸管吹打10~20次，然 后静置lmin左右，用吸管将组织下层的液体吸出如此反复直到所吸出的液体 呈透明状，不带有血细胞为止；3） 向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液（胰酶0.25%, I 型胶原酶0.1%，以1：1比例混合配制而成），将试管密封，放入37°C恒温摇床 中，190r/m in,震荡消化30min此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞 层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；4） 吸出离心管中的下层液体移入含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM） 的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；5） 用吸管吸取上清后去掉，加入1ml培养基，轻轻吹打10〜20次制成细胞悬液，将 各个离心管中的细胞悬液收集起来，接种待用；6） 在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶，重复以上步骤继续消化，重复2-3次，将 收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中，放入37°C、5% CO2培养箱7） 第一次换液：大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。

2. 脂肪干细胞传代培养1） 在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1- 2mL 消化液（0.25%胰酶和 0.04% EDTA（v/v 1:1））；2） 培养箱内进行消化（3-5min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁 的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细 胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；3） 用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡）， 使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；4） 将单细胞悬液移至离心管中，离心，（1000rpm,5min），弃上清，加入完全培养 基，轻吹使之松散，按1:2传代培养；5） 显微镜下逐日观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到90% 以上融合时，再进行 传代，如此反复3. 脂肪干细胞的冻存将传代培养的细胞悬液以lxl06cells/ml的比例加入预冷冻存液（含5% DMSO, 30%胎牛血清的DMEM），充分混匀后置预冷的冻存管中将冻存管置于-80°C低温 冰箱中过夜后,投入液氮中保存4. 脂肪干细胞的复苏1） 取出液氮中的冻存管，迅速投入37°C水浴中快速晃动，直至冻存液完全溶 解，复温在1-2分钟内完成；2） 用酒精棉球擦洗存有细胞的冻存管以减少污染；3） 无菌条件下吸出细胞悬液至离心管中，补加4ml培养基后离心（1000r/min, 5mi n），弃上清；4） 收集细胞，用培养基吹打成细胞悬液接种在培养瓶中，于37°C, 5%CO2培养箱 中培养。