ELISA双抗体夹心法实验报告ELISA双抗体夹心法实验报告精选八篇.docx

    ELISA双抗体夹心法实验报告ELISA双抗体夹心法实验报告精选八篇    篇一 ：ELISA双抗体夹心法ELISA双抗体夹心法点击次数：1、原理ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度2、特点某些分泌型蛋白，用siRNA 干扰后可以用ELISA 进行检测3、ELISA 实验流程示图（以双抗体夹心法为例） 320 作者：百奥迈科 发表于：2009-03-13 16:18 转载请注明来自丁香园4、试剂与耗材（1） 包被缓冲液 （pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液）：（2）洗涤缓冲液 （pH 7.4，0.15 M PBS）：（3）稀释液：（4）终止液（2 M H2SO4）：（5）底物缓冲液 （pH 5.0）：（6）四甲基联苯胺（TMB）使用液：（7）2，2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：（8）抗原、抗体和酶标记抗体：按说明书处理。

9）标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液10）96 孔聚苯乙烯塑料板 （酶标板）2、实验步骤（双抗体夹心法）：（1）包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10 μg/mL在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min2）加样：加一定浓度稀释的待检样品（同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照）0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，置湿盒中，37℃， 1 hr用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min…… …… 篇二 ：ELISA操作步骤(双抗体夹心法)ELISA操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中) 2 PBS洗3次，每次3分钟具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。

3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min4 PBS洗3次，每次3分钟5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl6 PBS洗3次，每次3分钟7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl（TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟8. 终止反应:每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。

用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)篇三 ：Elisa实验报告Elisa实验报告实验名称：酶联免疫吸附剂测定实验原理：酶联免疫吸附测定是一种免疫测定技术测定中，先使抗原吸附在固相载体上，然后加待测的抗体，再用某种酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体的“双抗体夹心”，此时酶仍保有活性，同时标记抗体亦有免疫活性之后再加入酶的底物，在酶的催化下产生反应并产生有色物，颜色深浅与待测物质的量直接相关至此，酶的催化放大作用与免疫反应的特异性相完美结合，提高了测定的准确性与灵敏度实验材料与试剂：1．聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 96孔)2．酶联免疫检测仪3．辣根过氧化物酶羊抗兔IgG4．包被液：0.05mol/L 碳酸缓冲液（pH9.6）：Na2CO3 0.15g,NaHCO3 0.293g，蒸馏水稀释至100 ml5．稀释液（PBS-Tween）：NaCl 8g,KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.9g,Tween-20，0.5ml，蒸馏水加至1000ml。

6．洗涤液：同稀释液7．封闭液：0.5%（质量分数）BSA（用PBS配制）8．邻苯二胺溶液(底物)：配制：0.1mol/L柠檬酸(2.1g/100ml), 取6.1ml，0.2mol/LNa2HPO4·12H2O (7.163g/100ml), 取6.4ml,加蒸馏水12.5ml,取邻苯二胺8mg（溶解）；临用前加30%（体积分数）H2O2 40μl9．终止液：2mol/L H2SO4实验步骤：１．包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10μg/孔，每孔加200μl, 37 ℃温育30min２．洗涤：倒尽板孔中液体，加200μl洗涤液，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽…… …… 篇四 ：ELISA双抗体夹心法ELISA双抗体夹心法摘要：ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复 合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。

以检测HbsAg为例找产品，上生物帮>> >>相关专题生物帮之抗体制备【原理】ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量以检测HbsAg为例材料】酶标抗体(HRP-抗HBs-IgG)、抗HBs-IgG、待检血清包被液 pH9.5 0.05 mol/L CB稀释液 pH7.4 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液底物液 0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)5.14 ml，0.05 mol/L枸橼酸(10.5g/L)4.86 ml混匀，加入邻苯二胺(OPD)4 mg，置棕色小瓶中，临用时加30% H2O2 4.0μl，混匀终止液 2 mol/L H2SO4温箱、酶标反应板、酶标分光光度计【方法】1. 包被 取包被液适当稀释的抗HBS-Ig 0.1 ml，加到聚苯乙烯反应板各孔中。

加盖，4℃ 24h次日用洗涤液充分洗涤3次，甩干2. 各孔内加不同稀释倍数的待检血清0.1 ml，同时加阳性和阴性对照血清，置43℃温箱60 min，移去液体同前法洗涤3次，甩干…… …… 篇五 ：ELISA(双抗体夹心法)—检测HBsAgELISA（双抗体夹心法）—检测HBsAg摘要：以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量 【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶 2、酶结合物 1 瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释 1瓶 6、显色剂（找产品，上生物帮>> >>相关专题ELISA免疫实验技术以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含:1、包被抗-HBs反应条1瓶2、酶结合物1瓶3、HBsAg阳性对照1瓶4、HBsAg阴性对照1瓶5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释1瓶6、显色剂(TMB)A1瓶7、显色剂(TMB)B1瓶8、终止液1瓶【方法】1、加入待测标本每孔0.05ml，并设HBsAg阳性对照2孔，HBsAg阴性对照2孔，空白对照1孔，然后加入酶结合物每孔1滴(0.05ml、空白对照孔不加)，充分混匀后置37℃孵育30分钟。

2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干3、显色剂:先加显色剂A每孔1滴(0.05ml)，然后再加显色剂B每孔1滴(0.05ml)，混匀，37℃孵育10分钟4、每孔加终止液1滴(0.05ml)，混匀结果】比色法:波长450nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值…… …… 篇六 ：双抗体夹心ELISA检测方法的建立1.材料与方法1.1检测样品的制备2C3株抗牛安氏隐孢子虫卵囊壁特异性单抗，其制备和纯化方法参照文献标准阳性粪便，采自粪栓阳性牛粪；标准阴性粪便，为经3次不同时间采粪便集虫后，抗酸染色卵囊均为阴性的牛粪，交叉反应粪便，为集虫粪检仅球虫或结肠小袋纤毛虫感染而无隐袍子虫感染的牛粪1.2. 酶标单克隆抗体的制备，参照文献[2：进行，其克分子比为1．961.3. 被险粪便处理方法：取粪2克加入含0.1％聚山梨酸20及2mmol/L乙二胺四乙酸的磷酸缓冲盐溶液5m1碾碎后过滤备用1.4.双抗夹心ＥＬＩＳＡ法工作程序聚乙烯反应板经0.0025％的戊二醛溶液等处理后，使其更易与抗原或抗体结合．置4℃冰箱备用包被液适当稀释兔抗体(ＩｇＧ),于微量酶标板每孔加100μｌ,置4℃过夜后,用洗涤液洗3次。

每孔加待测样品100μｌ,同时设阴性和试剂空白对照,放置37℃反应2ｈ,用洗涤液洗3次每孔加适当稀释的酶标抗体100μ1置37℃反应2ｈ,用洗涤液洗涤3次每孔加底物溶液100μｌ,室温暗处放置20ｍｉｎ显色,每孔加中止反应液50μｌ然后在酶标测定仪上测定490ｎｍ处的ＯＤ值以样品孔的ＯＤ值(Ｐ)与阴性对照孔的ＯＤ值(Ｎ)之比大于2(即Ｐ/Ｎ>2)时定为阳性1.5.双抗夹心ＥＬＩＳＡ法工作浓度的确定通过交叉连续稀释分析法确定用于检测一定浓度抗原所需兔抗体(Ｉ。