蛋白质组学(Proteomics).ppt

蛋白质组学（Proteomics）,,一.概念,蛋白质组学（Proteomics）一词，源于蛋白质（protein）与 基因组学（genomics）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1995年提出的蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目. 蛋白质组学(Proteomics)处于早期“发育”状态，这个领域的专家否认它是单纯的方法学，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域. 蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制.,二.研究内容,1.蛋白质研究1.1蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。

1.2翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用 1.3蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具2.细胞甚至亚细胞研究不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的，因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平可以利用免疫组织化学技术（利用标记物标记的抗体与组织或细胞的抗原反应，结合形态学检查，对抗原做定性、定量、定位检测的技术 ）达到这个目的三.研究意义和背景,研究意义蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。

虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求这是因为：(1) 生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质2) 多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果3) 在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究因此在上世纪90年代中期，国际上产生了一门新兴学科－蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一研究背景虽然第一次提出蛋白质组概念是在1995年，但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早，尤其是80年代初，在基因组计划提出之前，就有人提出过类似的蛋白质组计划，当时称为Human Protein Index计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质但由于种种原因，这一计划被搁浅。

90年代初期，各种技术已比较成熟，在这样的背景下，经过各国科学家的讨论，才提出蛋白质组这一概念国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia Proteome Analysis Facility ( APAF )丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心四.蛋白质组学技术,蛋白质组学技术的发展已经成为现代生物技术快速发展的重要支撑，并将引领生物技术取得关键性的突破蛋白组学技术主要包括双向凝胶电泳、等电聚焦、生物质谱分析及非凝胶技术1.双向凝胶电泳双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开由于双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置，它可用于蛋白质转录及转录后修饰研究，蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用，细胞分化凋亡研究，致病机制及耐药机制的研究，疗效监测，新药开发，癌症研究，蛋白纯度检查，小量蛋白纯化，新替代疫苗的研制等许多方面。

近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法2.等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术等电聚焦凝胶电泳依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离3.生物质谱生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术，其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子之间的荷质比（M/E）的差异来分离并确定分子量对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽键）成肽段，对这些肽段用质谱进行鉴定与分析目前常用的质谱包括两种：基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和离子阱质谱（ESI- MS）3.1基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱MALDI 的电离方式是 Karas和Hillenkamp于1988年提出。

MALDI的基本原理是将分析物分散在基质分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶体，当用激光（337nm的氮激光）照射晶体时，基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使样品分子电离它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用于肽质量指纹图谱，非常快速（每次分析只需3~5min），灵敏（达到fmol水平），可以精确测量肽段质量，但是如果在分析前不修饰肽段，MALDI-TOF-MS不能给出肽片段的序列3.2离子阱质谱（ESI-MS）ESI- MS是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器ESI-MS从液相中产生离子，一般说来，肽段的混合物经过液相色谱分离后，经过偶联的与连接的离子阱质谱分析，给出肽片段的精确的氨基酸序列,但是 分析时间一般较长 目前，许多实验室两种质谱方法连用，获得有意义的蛋白质的肽段序列，设计探针或引物来获得有意义的基因。

随着蛋白质组研究的深入，又有多种新型质谱仪出现，主要是在上述质谱仪的基础上进行改进与重新组合4.蛋白质组研究的新技术双向凝胶电泳存在繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标目前，二维色谱 (2D-LC)、二维毛细管电泳 (2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳 (LC-CE) 等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势另一种策略则是以质谱技术为核心，开发质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用 (CE-MS)等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物随着对大规模蛋白质相互作用研究的重视，发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测技术也被科学家所关注此外，蛋白质芯片的发展也十分迅速，并已经在临床诊断中得到应用五.发展趋势,1.在基础研究方面近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛2.在应用研究方面蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。

在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究3.在技术发展方面蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，构成组学（omics）生物技术研究方法，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。