对HPLC色谱峰面积与浓度线性关系的研究1.doc

HPLC色谱峰面积与浓度线性关系的实验一、实验目的：本实验是考察HPLC色谱仪在工作浓度范围内，样品峰面积与样品浓度的线形关系，是否符合要求二、实验仪器与试剂：1）岛津液相色谱仪：LC-10AT VP ；2）分析天平型号：AG-285 ；3）色谱柱：C18（ 4.6×250mm）4）样品：氨苄西林（浓度分别为2 mg/ml，1 mg/ml，0.2 mg/ml，0.02 mg/ml，0.01 mg/ml）；阿莫西林（浓度分别为2 mg/ml，1 mg/ml，0.5 mg/ml，0.02 mg/ml，0.01 mg/ml）；5）氨苄西林流动相：流动相A：12%的醋酸溶液:0.2mol/L磷酸二氢钾溶液:乙腈:水 = 0.5:50:50:900；流动相B：12%的醋酸溶液:0.2mol/L磷酸二氢钾溶液:乙腈:水 = 0.5:50:400:550；流动相A: 流动相B = 85:15；6）阿莫西林流动相： 流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(PH5.0) ：乙腈 = 97.5% ：2.5% 三、实验步骤：1．不同浓度氨苄西林样品溶液的配制：按2 mg/ml，1 mg/ml，0.2 mg/ml，0.02 mg/ml，0.01 mg/ml的浓度分别配制氨苄西林样品溶液，具体配制方法如下1） 精密称量氨苄西林胶囊内容物（含氨苄西林100mg）置于50ml容量瓶中，加流动相溶解，稀释至刻度，即得含氨苄西林溶液2 mg/ml，定为样品A。

2） 准确量取样品A25ml再加入流动相25ml混和均匀，即得含氨苄西林溶液1 mg/ml，定为样品B3） 准确量取样品A5ml再加入流动相45ml混和均匀，即得含氨苄西林溶液0.2 mg/ml，定为样品C4） 准确量取样品A1ml再加入流动相99ml混和均匀，即得含氨苄西林溶液0.02 mg/ml，定为样品D5） 准确量取样品A0.5ml再加入流动相99.5ml混和均匀，即得含氨苄西林溶液0.01 mg/ml，定为样品E2．将配制好的氨苄西林样品溶液样品A、B、C、D、E各量取20μl注入色谱仪，记录各色谱图3．以峰面积为Y轴，浓度为X轴作图，得相关系数，并计算5个样的响应值的相对标准偏差RSD（注：响应值=样品峰面积/样品浓度）4．按等倍稀释的原理配制浓度为2 mg/ml，1 mg/ml，0.5 mg/ml，0.02 mg/ml，0.01 mg/ml的阿莫西林样品溶液A、B、C、D、E，各量取20μl注入色谱仪，记录各色谱图5．同理，以峰面积为Y轴，浓度为X轴作图，得相关系数，并计算5个样的响应值的相对标准偏差RSD（注：响应值=样品峰面积/样品浓度）四、实验数据记录及处理：1．样品称量记录：氨苄西林胶囊，含量：82.23%，称样量：122.84mg阿莫西林胶囊，含量：63.37%，称样量：158.22mg2．实验图谱：氨苄西林溶液样品：A： 1 B： 2 C： 3 D： 4 E： 5 线形图： 6 阿莫西林溶液样品：A： 7 B： 8 C： 9 D： 10 E： 11 线形图： 12 3．实验数据处理如下：表1 氨苄西林溶液不同浓度下对应的峰面积样品浓度(X)样品峰面积(Y)响应值2 mg/ml862260.188431130.0941 mg/ml498096.406498096.4060.2 mg/ml145817.094729085.4700.02 mg/ml19407.100970355.0000.01 mg/ml10259.6001025960.000相关系数：0.99628RSD=36.74%表2 阿莫西林溶液不同浓度下对应的峰面积样品浓度(X)样品峰面积(Y)响应值2 mg/ml1932470.625966235.312 1 mg/ml1121146.6251121146.625 0.5 mg/ml649219.6251298439.250 0.02 mg/ml41360.1482068007.400 0.01 mg/ml23527.3012352730.100 相关系数：0.99480RSD=39.22%图1 氨苄西林溶液浓度与峰面积的线形关系图图2 阿莫西林溶液浓度与峰面积的线形关系图五、实验结果分析：1．在0.01mg/ml-2mg/ml 范围内，响应值随着浓度的降低逐渐升高，说明当样品被稀释时，样品的峰面积与浓度并不呈比例关系，而是越来越大，即当样品被一定比例稀释时，其峰面积并未等比例稀释，而是大于等比例稀释后计算值。

2．在测有关物质时，因等浓度杂质峰小，主成分峰大，主成分峰面积对杂质峰干扰大，故主成分峰测量样品为供试品稀释之后的样品，即对照溶液，下公式为《中国药典》中有关物质大小的计算公式， 供试品溶液杂质峰面积 对照溶液主成分峰面积×稀释倍数若对照品溶液为供试品溶液稀释100倍之后的样品，根据1的结果可得，当溶液浓度被稀释100倍后，所测峰面积并未被稀释100倍，而是大于稀释100倍后的计算若按照公式计算，可以得到计算结果小于实际结果，即按《中国药典》中的方法由高效液相所测得的有关物质的大小将小于样品中有关物质的真实值3．两组实验的相关系数分别为0.99628和0.99480，说明样品的浓度与峰面积在一定程度上来说，还是符合比例关系在测量样品含量时，因其对照品溶液与供试品溶液浓度接近，故其浓度与峰面积的比例关系可以看成近似成立，故高效液相法对含量测量结果的影响较小，几乎没有。