探讨牛血清白蛋白及呋喃妥因相互作用研究中光谱法的应用.docx

探讨牛血清白蛋白及呋喃妥因相互作用研究中光谱法的应用硝基呋喃类药物是一种人工合成的广谱抗生素,由于其对大多数的原虫和真菌病原体具有很好的杀灭作用,因此被广泛用于畜牧和水产养殖业中肠炎、赤鳍病、溃疡病等疾病的治疗[1]但美国食品药品监督管理局(FDA)指出,硝基呋喃类药物在动物体内降解非常迅速,具有致癌性[2],因此被欧美等国家列为食物性动物饲养过程中禁止使用的药物,但由于其价格低、药效好,仍被某些不法水产养殖者使用欧盟食品和饲料快速预警系统(RASFF)如今仍然可以从进出口的水产品中发现硝基呋喃类药物[3]血清白蛋白作为一种人和动物血液中重要的载体蛋白,可以与很多的内源性及外源性物质结合[4]本文以呋喃妥因(NFT)为例研究硝基呋喃类药物与BSA的相互作用机理,对于从分子水平上了解硝基呋喃类药物在生物体内的分布及毒性等具有一定的参考意义1、实验部分1.1主要仪器与试剂Fluoromax4型荧光分光光度计(法国HORIBA公司);UV2800型紫外-可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);FLS1000型稳态瞬态荧光光谱仪(英国爱丁堡仪器公司)BSA(分析纯,美国Sigma-Aldrich公司);NFT(分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);实验用水均为二次去离子水。

1.2实验方法实验1:固定BSA的浓度为1.0×10-5mol/L,变化NFT浓度为0～19.6×10-5mol/L,在25、30和37℃下测荧光光谱激发波长为280nm,发射波长为250～500nm,激发狭缝和发射狭缝均为5nm记录空白的荧光光谱,以扣除配体和缓冲液的荧光影响根据公式(Fcor=Fobs×e(Aex+Aem)/2)对荧光发射强度进行修正以消除内滤光效应[5]同步荧光光谱条件为Δλ=15nm或60nm,增量1nm,激发狭缝和发射狭缝均为5nm实验2:固定n(BSA)∶n(NFT)=1∶5,变化华法林或布洛芬的浓度为0～1.26×10-4mol/L,测定荧光强度实验3:固定n(BSA)∶n(NFT)为1∶1和1∶10,测定BSA与NFT作用前后的荧光寿命激发波长为280nm,发射波长为345nm,量子点数收集为5000,使用仪器自带软件进行荧光寿命拟合2、结果与讨论2.1NFT对BSA的荧光猝灭BSA与NFT作用的荧光光谱见图1,随着NFT浓度的增大,BSA在347nm处的荧光发射峰强度逐渐减小且最大发射峰蓝移至336nm,说明NFT与BSA发生相互作用[6],由于蛋白质分子在极性溶剂中的发射波长比非极性溶剂中大,因此可推断NFT使BSA周围发色团微环境极性降低。

图1BSA与NFT作用的荧光光谱曲线由上到下的cNFT分别为0、3.3、6.6、9.9、13.2、16.4、19.6×10-5mol/L荧光猝灭机制主要有动态猝灭和静态猝灭动态猝灭均符合Stern-Volmer方程[7](F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]),以F0/F对[Q]作图计算猝灭常数(见表1)NFT对BSA在3个温度下的猝灭速率常数Kq远大于生物大分子最大扩散碰撞猝灭常数2.0×1010L/(mol·s),并且Ksv随着温度的升高而减小,说明NFT对BSA的荧光猝灭主要为静态猝灭表1BSA与NFT作用的猝灭常数、结合常数、结合位点数及热力学常数2.2时间分辨荧光光谱根据与小分子作用前后BSA荧光寿命的变化可以判断NFT对BSA的猝灭类型对于静态猝灭,猝灭剂不会改变荧光分子激发态寿命,而动态猝灭,猝灭剂会缩短荧光分子激发态寿命荧光寿命可以根据方程〈τ〉=(B1τ1+B2τ2)/(B1+B2)计算[8]实验结果表明BSA的荧光寿命为τ1=4.82ns(25.78%),τ1=6.52ns(74.22%),平均寿命6.08ns(χ2=1.006)与NFT作用后,BSA的荧光寿命变为τ1=5.12ns(48.70%),τ1=6.90ns(51.30%),平均寿命6.03ns(χ2=1.022)。

NFT没有引起BSA荧光寿命的明显改变,因此推断NFT对BSA的猝灭主要为静态猝灭,这与荧光光谱的实验结果是一致的2.3共振散射光谱BSA与NFT相互作用的共振散射光谱如图2所示BSA本身的共振散射信号较弱,但随着NFT浓度的增大,体系的共振散射强度增强,其原因可能是NFT与BSA形成粒径较大的复合物,导致共振散射信号增强[9]图2BSA与NFT作用的共振散射光谱曲线由下到上的cNFT分别为:0、0.66、1.32、1.96、2.60、3.23×10-5mol/L2.4NFT和BSA作用的结合常数和结合位点数根据静态猝灭公式lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q][10],以lg[(F0-F)/F]对lg[Q]作图,得到结合常数KA和结合位点数n(见表1)由表1可知,KA值均大于104L/mol,说明了NFT和BSA之间存在中等强度的作用力,可以相对稳定的结合n值均近似为1,说明了NFT和BSA之间存在一个结合位点,NFT可以被BSA结合和运载2.5热力学参数及作用力类型小分子和蛋白质之间的相互作用力主要有疏水作用、氢键、范德华力以及静电作用力根据热力学参数焓(ΔH)和熵(ΔS)可以判断作用力类型[11]。

由Van′tHoff方程(lnKA=ΔH/RT+ΔS/R)及(ΔG=ΔH-TΔS)计算NFT与BSA作用的热力学参数(见表1)由表1可知,ΔG为负数,说明NFT和BSA的反应是一个自发进行的过程ΔH和ΔS均为负数,说明NFT与BSA之间的主要作用力为氢键和范德华力2.6作用距离根据Förster非辐射能量转移理论[12],由NFT的吸收光谱和BSA的发射光谱重叠积分求得J=1.34×10-14cm3·L/mol,临界距离R0=2.59nm,能量转移效率E=45%,NFT和BSA的作用距离r=2.67nmr<7nm且0.5R0

图3BSA与NFT作用的紫外-可见吸收光谱曲线由上到下的cNFT分别为:0、3.3、6.6、9.9、13.2×10-5mol/L2.7.2同步荧光光谱同步荧光光谱可以提供酪氨酸和色氨酸附近所处微环境变化的信息当Δλ=15nm或60nm时,所得的同步荧光光谱仅为酪氨酸残基或色氨酸残基的光谱特征[14]图4为BSA和NFT作用的同步荧光光谱,随着NFT浓度的增大,酪氨酸和色氨酸残基的荧光强度均发生猝灭,色氨酸残基的荧光发射峰略有蓝移(2nm),说明NFT诱导色氨酸残基周围微环境的极性减小而酪氨酸的荧光发射峰位置未观察到明显变化,这表明NFT主要通过改变BSA色氨酸残基的周围环境导致BSA构象的变化图4BSA与NFT作用的同步荧光光谱曲线由上到下的cNFT分别为:0、3.3、9.9、16.4、22.8、29.1×10-5mol/La.Δλ=15nm;b.Δλ=60nm2.8NFT与BSA结合位置的确定某些药物对BSA的结合具有特异性,例如华法林结合在BSA的位点Ⅰ,布洛芬结合在BSA的位点Ⅱ,位点探针的取代百分数可用公式(探针取代百分数(%)=F2/F1×100%)计算[15]实验结果表明,华法林使得NFT-BSA体系荧光强度明显降低,而布洛芬并没有引起显著的变化。

说明华法林与NFT竞争同一个位点,即NFT结合在BSA的亚结构域ⅡA处即位点Ⅰ处3、结论本文采用多种光谱法研究了BSA和NFT的相互作用机制结果表明,NFT与BSA主要通过氢键和范德华力形成新的复合物而导致了BSA荧光的猝灭NFT在BSA亚结构域ⅡA的位点Ⅰ有一个结合位点NFT诱导BSA色氨酸残基周围微环境的极性减小,改变BSA的二级结构,即NFT可能会影响BSA的某些生理活性参考文献：[6]李蔚博,张国文,潘军辉,等.呋喃唑酮与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱[J].南昌大学学报(理科版),2010,34(6):60-64.[7]韩永光,寿先苗,李晓飞.光谱法研究胞磷胆碱钠与牛血清白蛋白的相互作用[J].化学试剂,2019,41(4):402-405.[10]龚爱琴,金党琴,朱霞石.荧光法研究琥珀酸曲格列汀与牛血清白蛋白的相互作用及分析应用[J].光谱学与光谱分析,2018,38(1):157-160.[11]方庆,董澄宇,王宇,等.光谱法和分子对接方法研究罗利环素与人血清白蛋白的相互作用[J].光谱学与光谱分析,2018,38(3):990-996.[13]石婧楠,温毛桂,于青,等.鹅掌楸碱与牛血清白蛋白的相互作用研究[J].化学试剂,2018,40(6):513-517.赵刚,胡雪健,何茜,黄曦瑶.光谱法研究呋喃妥因与牛血清白蛋白的相互作用[J].化学试剂,2020,42(06):677-680.基金:国家自然科学基金资助项目(41602351).。