草酸钙晶体对大鼠肾小管上皮细胞损伤作用的实验研究.doc

1草酸钙晶体对大鼠肾小管上皮细胞损伤作用的实验研究作者：李成文，孙光，邓耀良，李盛宽，米华，刘德云【关键词】 一水草酸钙晶体Damage of calcium oxalate crystal to renal epithelial cells in ratsABSTRACT: Objective To investigate the mechanism of nephrolithiasis by studying the damage of attached calcium oxalate crystals to renal epithelial cells in normal wistar rats and the subsequent changes in cystic function. Methods Renal epithelial cells of normal rats were isolated and cultured respectively. On the fifth day of primary culture, culture media including oxalate ion (1, 3, 5mmol/L) and COM crystals (5mmol/L) were added to the cells of the experimental groups. Scanning electron microscopy (SEM) was used to investigate COM crystal attachment to renal epithelial cells after 8 hours. The activity of Na+ K+ ATPase and Ca2+ Mg2+ ATPase was also determined 2spectrophotometrically. Results There was no significant differences in cells Na+K+ATPase and Ca2+Mg2+ATPase activity between the oxalate group and the control group. However, there were apparent differences between the COM group and the control group. Conclusion COM attachment on cultured Wistar rat renal epithelial cells can cause cell damage, which may lead to nephrolithinsis.KEY WORDS: COM crystal; renal epithelial cells; damage摘要：目的 通过研究一水草酸钙晶体粘附于体外培养的Wistar 大鼠肾小管上皮细胞后引起的细胞功能变化，探讨尿路结石形成的机制。

方法 分离、培养正常雄性 Wistar 大鼠的肾小管上皮细胞，在原代培养第 5 天时，将细胞分成 3 组(空白对照组，草酸组及一水草酸钙组)，分别加入正常培养液，含有草酸钠(1、3、5mmol/L)的培养液及含有草酸钠 (1、3、5mmol/L)和一水草酸钙晶体(5mmol/L)的培养液，实验 8h 后利用扫描电镜观察一水草酸钙晶体对肾小管上皮细胞的粘附情况，并分别用比色法测定细胞的钙镁 ATP 酶和钠钾 ATP 酶的活性，观察比较细胞功能的变化情况结果 实验 8h 后，扫描电镜观察提示一水草酸钙组中有大量一水草酸钙晶体贴附于肾小管上皮细胞表面①在三个草酸梯度3浓度中，草酸组细胞钙镁 ATP 酶和钠钾 ATP 酶活性均未见明显下降，与对照组无显著性差异(P>0.05)；②在三个草酸梯度浓度中，一水草酸钙组细胞钙镁 ATP 酶和钠钾 ATP 酶活性均明显下降，与对照组及草酸组有显著性差异(P<0.05)；③在不同草酸浓度的一水草酸钙组间细胞钙镁 ATP 酶和钠钾 ATP 酶活性无显著性差异(P>0.05)结论 在高草酸环境下，对体外培养的 Wistar 大鼠的肾小管上皮细胞产生损伤作用的主要是一水草酸钙晶体而非游离草酸根离子。

一水草酸钙晶体粘附于肾小管上皮细胞以后，可以造成细胞的损伤，这一机制可能有助于肾结石的发生关键词：一水草酸钙晶体；肾小管上皮细胞；损伤一般认为，肾结石的形成是一系列化学的、生化的、生理的及分子调节等因素综合作用的结果[1]尿液中草酸钙浓度的过饱和有助于晶体的成核和生长过程但是，单个草酸钙晶体形成以后，只有粘附于肾小管上皮细胞的表面或者迅速地聚集形成较大的结晶以堵塞肾小管，否则，将被尿液迅速冲走，肾结石亦不会发生钙离子和草酸的结合需要一定的时间，同时需要肾脏内一定尿流率的存在因此，只有当草酸钙晶体粘附于肾小管上皮细胞表面以后，才有可能引发结石的形成[2]新生的晶体粘附于肾小管上皮细胞表面后引发的细胞反应在肾结石的形成过程中发挥着重要的作用[2]我们利用原代细胞培养技术，通过研究一水草酸钙晶体粘附于体外4培养的 Wistar 大鼠肾小管上皮细胞以后，对细胞产生损伤作用的情况, 以探讨尿路结石形成的机制1 材料与方法1.1 细胞培养及分组 健康 Wistar 雄性大鼠( 体质量 50-60g)28 只，每组 4 只，共 7 组戊巴比妥麻醉后无菌取肾去掉包膜，分离、剪碎肾皮质过筛网，获得肾小管节段，2g/L 胰蛋白酶消化，短时离心，获得单个肾小管上皮细胞，加入含有 10%新生小牛血清的RPMI 1640 培养液，充分吹打混匀，分装在 12 孔板中，置于培养箱(37℃，5% CO2)中培养[8] 。

1.2 实验方法 培养第 5 天细胞基本铺满孔板，去除培养液，对照组细胞加入正常培养液，每孔 3mL，草酸组(共 3 组) 细胞分别加入含草酸钠(1、3、 5mmol/L)的培养液，每孔 3mL，草酸钙组(共 3 组)细胞分别加入含草酸钠(1、3、5mmol/L) 和一水草酸钙(5mmol/L)的培养液实验 8h 后，电镜观察一水草酸钙晶体粘附到肾小管上皮细胞表面的情况，并分别用比色法测定细胞的钙镁ATP 酶和钠钾 ATP 酶的活性1.3 统计学方法 实验数据经核实后，应用 SPSS10.0 for Windows 统计分析软件分析，结果用±s 表示，均数的比较用 t 检5验2 结果细胞均于 24-36h 左右开始贴壁，48-72h 后细胞开始生长，96h 后细胞呈指数性增长， 120h 左右基本铺满孔板实验进行 8h后，扫描电镜观察可见大量的一水草酸钙晶体粘附于肾小管上皮细胞表面(图 1)各组细胞的钙镁 ATP 酶和钠钾 ATP 酶活性的结果(表 1)比较显示：①在三个草酸梯度浓度中，草酸组细胞钙镁 ATP酶和钠钾 ATP 酶活性均未见明显下降，与对照组无显著性差异(P>0.05)；②在草酸组中，不同草酸浓度的组间细胞钙镁 ATP酶和钠钾 ATP 酶活性无显著性差异 (P>0.05)；③在一水草酸钙组中，不同草酸浓度的组间细胞钙镁 ATP 酶和钠钾 ATP 酶活性无显著性差异(P>0.05)；④在草酸钙组中，三个草酸梯度浓度组的细胞钙镁 ATP 酶和钠钾 ATP 酶活性均明显下降，与对照组及草酸组均有显著性差异(P<0.05)。

表 1 实验 8h 后各组细胞钠钾 ATP 酶、钙镁 ATP 酶的活性（略）图 1 实验 8h 后扫描电镜检查显示大量一水草酸钙晶体粘附于肾小管上皮细胞表面 ×5000（略）63 讨论尽管国内外的学者对肾结石的形成机制作了大量的研究，但是，草酸钙结石的形成机制至今尚未被阐明一般认为，肾结石的形成是一个多因素参与的过程，这个过程包括尿液的过饱和、微小晶体的形成及结晶的生长和成熟等其中，微小晶体粘附于尿路上皮细胞的表面被认为是肾结石形成过程中必需和关键的一个环节[3]在本研究中，草酸钙组细胞加入一水草酸钙晶体 8h 后，扫描电镜检查结果提示确实已有一水草酸钙晶体粘附到大鼠的肾小管上皮细胞表面这一结果提示，在肾结石的形成过程中，一水草酸钙晶体粘附到肾小管上皮细胞的表面可能发挥重要的作用新生的晶体粘附于肾小管上皮细胞表面后引发的细胞反应据认为在肾结石形成过程中发挥重要的作用[2]Mary 等利用培养的BSC1 细胞系细胞进行研究时发现，一水草酸钙晶体粘附于 BSC1细胞系的细胞表面后，编码 cmyc、EGR1 、 Nur77、cjun、PAI1和 CTGF 等因子的基因表达都有不同程度的增加，而这些因子对原发性或继发性高草酸尿症病人肾间质的纤维化都起到很大的作用[4] 。

钙镁 ATP 酶、钠钾 ATP 酶是细胞膜重要的标志性酶，与细胞膜的转运功能密切相关，其损伤会引起细胞功能下降，甚至可引7起细胞死亡一些研究已经发现，草酸和草酸钙晶体可以对培养的肾小管上皮细胞产生损害作用，并认为这是促进肾草酸钙结石形成的一个危险性因素[57]但是，在高草酸环境下，对肾小管上皮细胞产生损害作用的是草酸根离子还是一水草酸钙晶体？在这方面研究不多本研究结果显示，在三个草酸梯度浓度中，草酸组细胞钙镁 ATP 酶和钠钾 ATP 酶活性均未见明显下降，与对照组无显著性差异；而在草酸钙组中，三个草酸梯度浓度组的细胞钙镁 ATP 酶和钠钾 ATP 酶活性均明显下降，与对照组及草酸组均有显著性差异这一结果提示，体外培养的 Wistar 大鼠肾小管上皮细胞在草酸根离子浓度达到 5mmol/L 时仍未对细胞产生明显的损伤作用在高草酸环境下，对体外培养的 Wistar 大鼠的肾小管上皮细胞产生损伤作用的主要是一水草酸钙晶体而非游离草酸根离子一水草酸钙晶体粘附于肾小管上皮细胞以后，可以造成细胞的损伤，这一机制可能有助于肾结石的发生参考文献：[1]Bigelow MW, Wiessner JH, Kleinman JK, et al. Calcium oxalate crystal attachment to cultured kidney epithelial cell lines [J]. J Urol, 1998,160:15281532.[2]Lieske JC, Toback FG. Regulation of renal epithelial 8cell endocytosis of calcium oxalate monohydrate crystals [J]. Am J Physiol, 1993, F800F808.[3]Bigelow MG, John H, Wiessner, Neil S, et al. Calcium oxalatecrystal membrane interactions: dependence on membrane lipid composition [J]. J Urol, 1996,155:10941098.[4]Hammes MS, Lieske JC, Pawar S, et al. Calcium oxalate monohydrate crystals stimulate gene expression in renal epithelial cells [J]. Kidney Int，1995,48:501509.[5]Schied C, Koul H, Narod JL, et al. Oxalate toxicity in LLCPK1 cells: Role of free radicals [J]. Kidney Int, 1996,49:413419.[6]Scheid C, Koul H, Hill WA, et al. Oxalate toxicity in LLCPK1。