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虾类黑变机理多酚氧化酶一 、引言1 多酚氧化酶的性质 2 酶促褐变的生理作用 二、酚氧化酶的生物化学和分子生物学性质 三、褐变控制 1 物理处理 2 抑制剂 • 食品的外观，风味，质地和营养价值是 消费者选择食品时的四个因素重要的 是颜色，也是消费者评价食品质量的首 要因素之一通过酶促反应或非酶促反 应形成的颜色，影响着许多水果、蔬菜 和海洋食品尤其是甲壳类食品的最重 要的颜色反应之一酶促褐变反应，是多 酚氧化酶引起的，这种酶曾经被称为酚 氧化酶，酚酶，一元酚和二元酚氧化酶 和酪氨酸酶1 问题1.1黑变病酚氧化酶能导致甲壳类，如龙虾和蟹变黑，被 称为黑变病1.2多酚氧化酶的性质多酚氧化酶能催化两种基本的反应用苯酚和氧 气作底物，该反应能在与羟基相连的位置催化羟基化 反应第二步反应是二元酚被氧化为邻位苯醌，苯醌 常通过非酶反应机理进一步氧化成黑色素（褐色产物）1/2O2O2+ 2H2O一元酚氧化酶 一元酚氧化酶催化一元酚羟基化成为二元酚种酶被称为酪氨酸酶，因为L-酪氨酸是主要的一元酚底物二元酚氧化酶 第二步反应即二元酚被氧化成醌，被称为二元 酚氧化酶活力或儿茶酚氧化酶活力进一步反应是儿茶酚被氧 化成为邻位-苯醌。

虫漆酶 虫漆酶（对-二元酚氧化酶，E.C.1.10.3.2）（DPO）是 另外一种类型的含铜的多元酚氧化酶对于其酚底物具有明显 的非特异性底物被虫漆酶氧化是由于单一电子反应生成自由 基氧气被还原成水的同时酚类底物也被氧化 1.2 酶促褐变的生理作用 • 抗病能力被认为是多酚氧化酶在动物体内的功 能之一，主要存在于昆虫和甲壳类动物中该 酶在动物体内常以酶原或多酚氧化酶前体形式 存在 • 它对甲壳类动物中的骨化过程起到重要的作用 • 黑色素和部分聚合酚醛塑料具有抗微生物的性 质据说特殊的微生物能诱导产生能激活多酚 氧化酶的蛋白酶微生物次级代谢产物例如， 葡聚糖，糖蛋白，脂多糖，海带多糖和其它一 些产物也能诱导产生能激活多酚氧化酶的蛋白 酶 2．酚氧化酶的生物化学和分子生物学性质PPOs是含铜的蛋白质在所有PPO顺序中最显著的特征是两个 铜结合位点，被称为CuA和CuBPPO的活性位点由两个铜离子构 成，每个铜离子与三个保守的组氨酸残基结合这一对铜离子是PPO 与氧气和酚类底物相互作用的位点在甲壳类中，PPO体系以无活性的酚氧化酶原（proPO）形式存 在于血淋巴中，因此，PPO来源于血蓝蛋白。

血蓝蛋白是在甲壳类 血淋巴的血浆中发现的氧气运输蛋白血蓝蛋白和PPOs存在由两个 铜离子直接与蛋白质结合而形成的氧结合位点；但是，血蓝蛋白不 起催化作用纯的proPO的分子量为76kDa它是一种等电点在5.4 左右的糖蛋白PPO活性的最适pH值在pH6.0和pH8.0之间 温度对甲壳类PPO的稳定性影响表明这些酶在20-50℃范 围内具有相似的稳定性 PPOs的稳定性是非常不同的，它依赖于许多因素，如 温度，pH，底物浓度，离子强度，缓冲体系等3．褐变控制 • 多酚氧化酶（PPO）催化酚氧化生成邻 位-醌邻位-醌是活性很强的化合物它 们自发聚合形成高分子量化合物或黑色 素，或与氨基酸和蛋白质反应而加深颜 色阻止酶促褐变可以通过多种途径来 实现方法论上是除去一种或多种反应 必需的成分：氧气、酶、铜或底物3.1 物理处理 加热 冷藏 冷冻 干燥 辐射 高压和超临界CO2 3.2 抑 制 剂• 褐变抑制剂在食品加工中的应用受毒性 ，对味道，风味，质地和价值的影响因 素的制约，用于防止酶促褐变的抑制剂 有5类： • 1）还原剂；2）螯合剂；3）酸化剂；4）酶抑制剂；5）络合剂； 3.2.1 还原剂/抗氧化剂亚硫酸盐试剂 硫酸盐是PPO的一种竞争性抑制剂，能使PPO活 性位点的巯基结合。

L-抗坏血酸 抗坏血酸抑制的机理基本上被归结为还原-酶促形成 邻位-醌成原来的二元酚，从而阻止色素的形成异抗坏血酸 异抗坏血酸和它的盐异抗坏血酸钠都是很强的还原 剂它们是氧惰性剂，因此能抵抗还原分子中的氧 酚类抗氧化剂 抗氧化剂通过抑制生成自由基的氧化反应过程， 螯合金属和惰性单线态氧来延缓酸败或变色，从而保藏食品 半胱氨酸 半胱氨酸能抑制黑变病被推测是形成了无色的硫醇-邻 位-醌，它甚至直接与PPO上的铜生成稳定的复合物而抑制酶活 3.2.2 酸化剂 • 酸化剂的作用是将pH控制在PPO最佳 催化活性所要求的pH之下酸化剂如， 柠檬酸，苹果酸；磷酸能将pH降到3以下 ，在这个pH下PPO是无活性的酸化剂 经常与其他抗褐变剂结合使用柠檬酸 和抗坏血酸一种是食品工业中使用的最 广泛的酸之一 3.2.3、螯合剂 • 在它们的活性位点有金属离子，因此 通过螯合剂除去它们的金属离子将使酶 失去活性螯合剂通过它们能起到络合 或螯合的作用的分子结构中的不共用电 子对与强氧化剂如铜铁离子络合由于 PPO 是含铜的金属蛋白像辅基一样，它 将被金属螯合剂抑制在食品中应用的 最好的GRAS螯合剂是柠檬酸和乙二胺环 己酸（EDTA）。

EDTA EDTA与铁、铜、钙通过螯合反应生成非常稳定的络 合物在羧基完全解离的高pH下，EDTA的螯合效果最好 在阻止酶促褐变中，EDTA通常与其他化合试剂合用 磷酸盐 多磷酸盐，焦磷酸钠，金属磷酸盐都是螯合剂，由 于它们在冷水中是微溶的，因而用在食品中作为抗褐变试剂 时的浓度为0.5-2%麦芽酚 麦芽酚（3-羟基-2-甲基-4氢-吡喃-4-one），一种γ吡 喃酮的衍生物麦芽酚不能直接抑制PPO，但它能通过与邻 位-醌的结合使其重新生成邻位-二羟基醌或使PPO不可逆灭 活来抑制褐变曲酸 曲酸（5-羟基-2-羟甲基-4H-吡喃-4-one）是一种γ吡喃 酮衍生物，是许多曲霉菌和青霉菌的代谢产物酪氨酸酶被 曲酸的抑制可能是由于它能和酶活性位点的铜结合，因为曲 酸是非常好的过渡金属如铁（Ⅲ）和铜（Ⅱ）的螯合剂 3.2.4、 络合剂 •甲壳胺 甲壳胺来源于有壳的水生动物，甲壳 质为β（1，4）-D-胺基葡萄糖的多聚体甲壳 胺无毒，生物可降解，有抗微生物作用作用 机理还不清楚，可能是带正电荷的多聚体能吸 收悬浮的PPO的底物或产物的原故 •环状糊精 环状糊精是一类由液化淀粉在葡聚 糖转移酶作用下经环状麦芽糊精而生成的环状 寡糖。

CD抑制褐变的机理主要是它们能与PPO 的底物结合β-CD的中央空穴有较弱的非极性 与PPOs酚类形成包含络合物，因而能阻止醌的 氧化和随后的聚合，从而阻止黑色素的生成3.2.5、 酶抑制剂 • 4-已基间苯二酚 被取代的间苯二酚，它们的结构与酚 类底物相关，被认为是PPO的抑制剂间苯二酚衍生物 与酚类底物的结构相类似，通过对PPO的竞争性抑制来 阻止褐变反应4-已基间苯二酚（4-HR）能抑制酪氨酸 的一元酚氧化酶和二元酚氧化酶活性•卤化盐 无机卤化盐是很有名的PPO抑制剂NaF是最 强的PPO抑制剂，其他依次是NaCl，NaBr，和NaI蜂蜜 蜂蜜可以抑制酶促褐变蜂蜜对PPO起抑制作用 的化合物是分子量为600的小肽因为蛋白质、肽和氨 基酸通过螯合PPO活性中心的Cu2+形成稳定络合物来抑 制PPO的活性，这可能就是蜂蜜肽的抑制机理氨基酸，肽和蛋白质 氨基酸，肽和蛋白质通过直接抑制酶或通 过与PPO催化产物醌反应来抑制PPO催化的褐变它们也能通过 与催化各酚底物螯合PPO的活性位点的铜来抑制PPO活性蛋白 质，肽和α-氨基酸能和铜离子形成稳定的络合物组氨酸和半胱 氨酸对铜离子有特别高的亲和力，因为组氨酸有咪唑环，半胱氨 酸有巯基，二者都能连接金属离子。

芳香族羧酸 苯甲酸和肉桂系列的芳香族羧酸是PPO的抑制剂， 同时它们的结构与底物的结构相类似肉桂酸和它的类似物， 对位-对羟基桂皮酸，阿魏酸和芥子酸被发现是植物PPO的强烈 抑制剂 对虾黑变的新机理 总产总产量对虾对虾 (吨 )鹰鹰爪虾虾 (吨 )毛虾虾 (吨 )199666081255292 163060 442460 199772442969406 174967 480056 199882535178350 175618 571383 1999104991069911 400786 579213 2000109200484334 312436 625234 我国海捕虾产虾产量海水养殖虾产虾产量总产总产 量南美白对虾对虾斑节对虾节对虾中国对对 虾虾日本对虾对虾20034930613343416057954380451732004535230308947510866168542400南美白对虾（P.vannamei） 南美白对虾原分布在中、南美洲太平洋沿岸水域，外形似 中国对虾，正常体色为浅灰色，壳薄体肥，肉质鲜嫩，出肉 率高达65%以上，营养丰富，深受国内外市场欢迎；生长速 度快，养殖60天即可上市； 为当前世界上养殖最普遍的品种。

我国南 方沿海可以养两茬该虾生长快，适应性 强，食性杂，巳可耐受较长时间的干露，故 易干活运销该虾是对虾中个体最大的一 种，发现的最大个体长达33厘米，体重500 ～600克 斑节对虾P. monodon日本对虾对虾Penaeus japonicus 日本对虾是日本最重要的对虾养殖 品种，在日本养到25克左右出售价 格最高， 鹰鹰爪虾虾（对虾对虾科）Trachypenaeus curvirostris 中国水产品的进出口贸易情况年份出口量 （万吨）出口值值 （亿亿美元）进进口量 （万吨）进进口值值 （亿亿美元）2000153.438.3252.018.52001195.341.9231.418.82002208.546.9249.122.72004242.169.33298.632.4中国2002年出口量排列前五位的依次是冻鱼及鱼片（占 46.1%），头足类（占18.1%），各种加工鱼类及罐头（ 5.8%），养殖虾（5.2%）和烤鳗（3.2%）出口额排在前五位的是冻鱼及鱼片（30.0%），头足类 （16.4%），烤鳗（12.6%），养殖虾（12.2%），加工 鱼类及罐头（6.0%） egg of salmon/troutPrawns $ 3 billionstunasalmon/troutcrabcodoctopusflat fishsalted fishegg of herringeelothers fish powder1998 Total 14.5 billion dollarscuttle fishprocessed products对虾的黑变1、引起虾类黑变真正原因是什么？2、血蓝蛋白是怎样被激活的？3、血蓝蛋白在对虾中的存在位置？4、血蓝蛋白仅仅氧化酪氨酸吗？5、是否还有其它因素能引起虾类的黑变？1、引起虾类黑变真正原因是什么？DOPAMelaninDOPA quinoneNHOO2COOH5, 6-dihydroxyindole (DHI)DOPA chromePhenoloxidase (PO)Tyrosine虾类黑色素的形成 -目前普遍被接受的形成机理多酚氧化酶酶原的激活机理Prophenoloxidase(ProPO) Phenoloxidase(PO)ProPO SystemBeta-1,3 glucan, LPS, Peptidoglycanprophenoloxidase activating factorp-APMSF－1,3葡聚糖， 脂多糖，肽聚糖02040608010012012340 Storage time (week)ProPOPOPO activity during storage at –20℃Residual activity (%)多酚氧化酶原的cDNA序列及由cDNA序列推导出的氨基酸序列Pacifastacus。