第十四章DNA的复制与修复讲义资料.ppt

第十四章 DNA的复制与修复 DNA的复制、反转录以及DNA损伤的修复 主要内容：一、DNA的复制 （一）DNA的半保留复制（semicoservative replication） 1958年Meselson和Stahl用同位素示踪和密度梯度离心的方法证明了DNA的半保留复制 DNA聚合酶催化的反应 ndATPndGTPndCTPndTTP模板（DNA），引物（RNA，DNA）DNA聚合酶DNA 4nPPiDNA聚合酶的作用机理 在大肠杆菌中至少发现了五种DNA polymerase，分别是DNA polymerase I、II、III、IV和V，其中Polymerase I发现最早（1956年），而polymerase IV和V直到1999年才发现 DNA polymerase I（pol I）：1956年Kornberg等在Ecoli中发现的第一个DNA聚合酶，是DNA复制研究中的重要里程碑，因此于1959年Kornberg获得诺贝尔化学奖 DNA pol I 也称Kornberg酶, Mr 103 Kd, 一条多肽链,一个锌原子（活性所必需），每个E.Coli细胞内大约有400个分子的pol I。

（1）53聚合作用（2）35核酸外切酶的活性（3）53核酸外切酶的活性（4）焦磷酸解作用（5）焦磷酸基交换的作用 因此它属于一种多功能酶功能（1）53聚合作用： DNA pol I 不能“从无到有”，只能从已有的多核苷酸链的3-OH端延长DNA链，也就是说必须要有Primer, primer多数情况下是RNA，少数情况下是DNA，Primer必须要有一个游离的3-OH 模板： 单链DNA（单链线状DNA、单链环状DNA） 局部变成了单链的双链DNA 有切口（nick）的双链DNA 有缺口（gap）的双链DNA 注意：完整的双链DNA不能作模板 单链线状DNA单链环状DNAB. 局部变成了单链 的双链DNAC. 有切口（nick）的双链DNAD.有缺口（gap）的双链DNA模板引物53 53 A.单链DNA5 3 3 3 5 缺口填充3 3 3 5 5 3 用胰蛋白酶或其他蛋白水解酶处理DNA pol I可以得到两个片段A.大片段：第324928氨基酸残基组成，Mr68000， 具有聚合酶的活性和35核酸外切酶 的活性，这大片段称Klenow fragment B.小片段：第1323个氨基酸残基组成，Mr 35000， 具有53核酸外切酶的活性。

大片段：35核酸外切酶主要功能校对 53核酸外切酶的主要功能在DNA修复和切除引物中起作用 小片段： Pol II是由一条Mr为88Kd的多肽链组成，它的活性大约只有polI活性的5%，也要模板和带3OH 的引物，最好的模板是带短的gap的双链DNA，有53聚合酶和35核酸外切酶的活性，但没有53核酸外切酶的活性，主要用于DNA的修复 DNA Polymerase II（DNA pol II）：1970年和1971年先后分离出pol II和pol III， 是由多种蛋白质组成的复合物, Mr 高达900Kd 每个Ecoli约含10分子DNA pol III，虽然pol III的量很少，但活性很强，为pol I的15倍，模板和pol II大致相同，除聚合酶活性外，还具有35核酸外切酶的活性，但无53核酸外切酶的活性，DNA pol III是原核细胞DNA复制的主要酶它催化脱氧核苷酸的合成速率达到体内DNA的合成速率这个酶的缺陷株往往是致死的 DNA polymerase III(DNA pol III)：DNA polymerase IV和V（DNA pol IV和V）： 1999年才被发现，涉及DNA的错误倾向修复，当DNA受到严重损伤时，即可诱导产生这两种酶，使修复缺乏准确性，因而出现高的突变率。

大肠杆菌三种DNA聚合酶的比较pol Ipol IIpol III分子量103Kd88Kd900Kd不同种类亚基数目1 7 10每个细胞的分子数40010010生物学活性10.051553聚合酶活性35外切酶活性53外切酶活性功能 校正，修复，去除RNA引物修复复制（53聚合作用）真核生物DNA pol； 有DNA pol.、5种，除DNA pol r存在于线粒体内，其余均存在于细胞核中它们的差别除了细胞定位外，主要在于动力学性质和对抑制剂的敏感性不同其他性质基本上同E coli的聚合酶，也需要模板, 带3-OH的引物和4种脱氧核苷三磷酸，链的延伸方向为53 哺乳动物DNA聚合物定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核聚合方向：53 外切酶活性35功能引物合成修复线粒体DNA合成核DNA合成修复2. DNA 连接酶（DNA ligase） 3. 使DNA双螺旋解开所需的酶或蛋白质 （1）DNA helicase （DNA 解螺旋酶，DNA解 旋酶，DNA解链酶）: 目前已知E.Coli含有4种解螺旋酶，即解螺旋酶I、II、III和Rep蛋白，其中Rep蛋白是E.Coli中最主要的解螺旋酶，每解开一个碱基对需水解2分子ATP。

通过水解ATP打断互补双链间的氢键 通过水解ATP获得能量, 使双螺旋DNA两条链分开2）Single-strand binding proteins（SS-B，单 链结合蛋白）： 功能：与解开双螺旋后的单链DNA结合，防止单链DNA重新形成双螺旋，另外防止单链DNA被核酸酶降解 原核生物的SS-B与单链DNA的结合表现为正协同效应，而真核生物的SS-B就没有这种协同效应 这酶首先在E.Coli中发现，当时称-蛋白，后来在真核生物中也发现了类似活性的酶，真核生物中的这类酶名称各不相同，有称nicking-closing enzyme （切口开合酶，切口闭合酶等），untwisting enzyme（解缠酶） （3）topoisomerase I （拓扑异构酶I，Top I）: 这个酶的功能是切开超螺旋双链DNA中的一条链，链的切口末端就可转动，使DNA变成松驰状态，然后再将切口封闭，这酶作用时不消耗ATP 它的功能也是使超螺旋松驰在消耗ATP的情况下，能将复制叉前方产生的正超螺旋变成负超螺旋在无ATP时，可同时切开超螺旋的两条链，使DNA变成松驰状态，然后将切口封接好，克服解链过程中在复制叉前方造成的“打结”现象。

（4）topoisomerase II（拓扑异构酶II，Top II）： 这酶首先也是在E.Coli中发现，也称DNA gyrase （DNA旋转酶），Top I和Top II使超螺旋松驰机制的相似处和不同处 （三）DNA的复制过程 1. DNA复制的起点和方向： 原核生物：1个起点（origin of replication，复 制起点，复制原点） 复制起点核苷酸序列的特征:（1）碱基序列高度保守2）富含AT，有利于DNA的解链方向: 大多为双向复制E.Coli染色体DNA复制: 复制时有一个复制起点，双向展开，形成状中间物，直至两个复制叉相遇，这种复制称复制 复制子: 受同一个复制起始区控制的DNA被称为复制子（replicon），它是复制的功能单位 原核细胞DNA复制只有一个复制起始区，因此它只有一个复制子通常细菌、病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的 真核生物：有很多复制起点，复制方向也是双向真核细胞的细胞核DNA复制有多个复制起始区，因此它包含多个复制子 起点起点+复制眼在复制的起始点处，DNA双链部分解开为单链，形成叉子形状称复制叉（replication fork）。

大多数生物DNA的复制是双向的，但也有例外，如滚环式复制（rolling circle replication） 2. DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication） 所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是531968年日本学者Okazaki冈崎提出了DNA的不连续复制模型，他认为35走向的DNA链的合成是不连续的，是由许多53方向合成的DNA片段连接起来的，这些不连续的DNA片段称为冈崎片段（Okazaki fragment）原核细胞冈崎片段的长度为10002000个核苷酸，相当于1个顺反子（cistron）的大小，即基因的大小；真核生物冈崎片段的长度为100200个核苷酸，相当于1个核小体DNA的大小 35走向的DNA链是不连续的，另一条链根据最近的实验，认为53走向的DNA链是连续的，因此称semidis continuous replication 在DNA复制时，以35方向为模板合成的一条新链是连续的,称前导链（leading strand），它的延伸方向与复制叉的移动方向相同另一条新链的合成是不连续的，由许多53方向的冈崎片段组成，这条新链称后随链（lagging strand），它的延伸方向与复制叉的移动方向相反。

DNA聚合酶不能“从无到有”地合成多核苷酸链，只能从已有的多核苷酸链上延长，这个已有的多核苷酸链就是引物，所以DNA的合成必须要有引物，体内的引物多数情况下是RNA，但也可利用体内原有的DNA片段 RNA引物是以单链DNA为模板，沿53方向合成小分子RNA引物，在大肠杆菌中RNA引物（RNA primer）由引发酶（primase）催化，引物的长度160个核苷酸（引物的长度取决于物种） 3. DNA的合成需要以RNA为引物:合成RNA引物的过程称引发，引发是一个十分复杂的过程 Preprimosome预引发体或称前引发体 4. 引发 primosome引发体 priming引发 （a）大约20个DnaA蛋白各带1个ATP结合到4个9bp的重复序列上，DNA缠绕在上面，形成起始复合物（initial complex） （b）HU蛋白是类组蛋白，可与DNA结合，促进起始，受其影响，邻近的三个13bp重复序列被变性成开链复合物（open complex），即解链而形成小段单链，所需能量有ATP供给 （c）DnaB（解链酶）在Dnac的帮助下结合于解链区，DnaB借助水解ATP产生的能量，沿DNA链53方向移动，解开DNA的双链，此时称为prepriming complex，i.e.preprimosome，再与引发酶（primase）组装成引发体（primosome），才能起引发作用。

5. DNA复制叉的结构和链的延长 DNA复制时，DNA双螺旋的解开靠helicase（解螺旋酶）、SS-B 、 Top II（i.e DNA gyrase), RNA引物合成后，DNA pol III与复制叉结合，形成复制体（replisome）的结构，而启动DNA的合成 replisome：为大的多分子复合物，由DNA pol III以及其他酶和蛋白质组成，组装于细菌染色体的复制叉，并在DNA复制中完成各种各样的反应 复制起点解开后形成2个复制叉，进行双向复制，前导链和后随链的合成都需要RNA引物，前导链先由引发酶在起点处合成一段RNA引物，随后DNA pol III即在引物上加脱氧核苷酸前导链的合成与复制叉的移动保持同步 后随链的合成是分段进行的，需要不断合成冈崎片段的RNA引物，然后由DNA pol III加入脱氧核苷酸 后随链的合成比较复杂，由于DNA的两条互补链方向相反，为使后随链能与前导链被同一个DNA pol III不对称二聚体所合成，后随链必须绕成一个环状（loop） 合成冈崎片段不断与模板脱开，然后在新的位置又与模板结合 6链的终止 （1）除去引物：DNA polI，有53核 酸外切酶的活性，可把RNA引物除去， 所出现的缺口（gap）由DNA polI按 模板要求将缺口填满。

（2）DNA连接酶将相邻的两个核苷酸的磷 酸二酯键连接起来成大分子DNA，再 形成一定的空间结构DNA复制总结真核生物DNA复制与原核生物DNA复制大体相同，但有差异 （1）原核生物每时每刻都在复制，而真核生物。