ITS测序PPT课件.ppt

利用ITS序列鉴定未知真菌 温永芳2015.6.122021/6/711：ITS鉴定原理2：PCR原理3：电泳原理4：具体操作目录2021/6/72微生物鉴定生理生化形态学鉴定：菌落形态、孢子形态等分子鉴定细菌：16s rDNA真菌：ITS序列2021/6/73一、 ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法ITS序列利用真菌rDNA上的5.8s，18s和28srDNA序列之间的转录间隔5.8s，18s和28srDNA序列进化上高度保守，而ITS序列由于选择压力小，在自然中变异较快，在绝大多数真菌中表现出序列多态性，表现为种内相对一致，种间差异比较明显，非常适合真菌鉴定以及系统发育分析2021/6/74二、PCR原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面2021/6/751234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍2021/6/76 DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比三、琼脂糖凝胶电泳原理2021/6/77* 提取微生物样品DNA* 扩增出真菌ITS区序列* DNA测序，将样品序列与GenBank中已知序列进行比对* 判定微生物种类，可将微生物划分到属或种* 与同源性较高菌种构建系统发育树鉴定步骤包括：2021/6/78在PDA上培养七天的未知真菌一株实验材料2021/6/79离心机 水浴锅研钵 微量移液器仪器用具2021/6/710电泳仪器和试剂电泳仪、电泳槽、灌胶模具等琼脂糖、TEV缓冲液、样品缓冲液2021/6/711uCTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。

uCTAB提取缓冲液：2%W/V CTAB;100mM Tris-Cl pH 8.0;20mM EDTA, pH 8.0; 1.4M NaCl一、真菌基因组DNA提取2021/6/712（1）取真菌菌丝0.2g，用液氮研磨充分，装入含有0.5mL预热的CTAB提取缓冲液的1.5mL离心管中,迅速混匀,在65水浴中保温1h,期间不定时摇匀；（2）放置室温，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(V/V: 25241)轻柔混匀，4、7500g离心10min；抽提去蛋白（3）取上清加入0.6倍体积异丙醇，室温下静置15min；沉淀核酸（4）4,10000g离心15min，取沉淀，用75%乙醇洗2次，无水乙醇洗一次，真空干燥5min；（5）将沉淀溶解在200L pH8.0 TE Buffer中注：酚-氯仿-异戊醇于棕色瓶中4保存DNA提取操作步骤2021/6/713二、PCR加样体系真菌DNA模版2L10buffer2.5LMgCl2（25mM）2LdNTP（各2.5mM）2L上游引物ITS1 （10M）1L下游引物ITS4 （10M）1LrTaq酶（5U/L）0.3LddH2O14.2L总体积25L2021/6/714PCR反应条件94预变性4min； 94变性1min 50退火1min 72延伸1min72总延伸10min；10 保温。

32个循环2021/6/7151.凝胶制备 制备1.0%琼脂糖凝胶称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 时，缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子2.加样 取10l DNA样液与 2l 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳4.EB染色5.观察拍照三、琼脂糖凝胶电泳2021/6/7162021/6/717泳道1：DL2000泳道2：PCR产物2021/6/718ITS测序结果1 TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA CCGAGTGCGG GTCCTTTGGG CCCAACCTCC61 CATCCGTGTC TATTATACCC TGTTGCTTCG GCGGGCCCGC CGCTTGTCGG CCGCCGGGGG121 GGCGCCTTTG CCCCCCGGGC CCGTGCCCGC CGGAGACCCC AACACGAACA CTGTCTGAAA181 GCGTGCAGTC TGAGTTGATT GAATGCAATC AGTTAAAACT TTCAACAATG GATCTCTTGG241 TTCCGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAACTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG301 TGAATCATCG AGTCTTTGAA CGCACATTGC GCCCCCTGGT ATTCCGGGGG GCATGCCTGT361 CCGAGCGTCA TTGCTGCCCT CAAGCCCGGC TTGTGTGTTG GGTCGCCGTC CCCCTCTCCG421 GGGGGACGGG CCCGAAAGGC AGCGGCGGCA CCGCGTCCGA TCCTCGAGCG TATGGGGCTT481 TGTCACATGC TCTGTAGGAT TGGCCGGCGC CTGCCGACGT TTTCCAACCA TTTTTTCCAG541 GTTGACCTCG GATCAGGTAG GGATACCCGC TGAACTTAAG CATATCAATA AGCGGAGGA登陆Genbank blast比对2021/6/719序列比对分析2021/6/720谢谢！2021/6/721部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！。