核酸的分离与纯化.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,核酸的分离与纯化,背景,核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸提取也成为了分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作核酸提取亦是临床分子诊断最关键的操作，直接关系到实验的成败与否，是临床分子诊断容易发生问题步骤核酸的存在形式,DNA,：细胞核,DNP,线粒体 环状,DNA,RNA,：细胞质中，,mRNA,，,rRNA,，,tRNA,通常与蛋白质结合，形成,RNP,核酸的理化性质,DNA,、,RNA,和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，,RNA,钠盐在水中溶解度可达,40g/L,DNA,在水中为,10g/L,，呈黏性胶体溶液在酸性溶液中，,DNA,、,RNA,易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定DNP,在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在,0.14 mol/L,的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的,1%,，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至,1mol/L,氯化钠中的溶解度很大，比纯水高,2,倍RNP,在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在,0.14mol/L,氯化钠中溶解度较大。

核酸提取方法,核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开核酸提取时应遵循以下原则,:,1,、保证核酸分子一级结构的完整性,;,2,、排除其他分子污染核酸提取方法,大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括：,细胞裂解,、,酶处理,、,核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化,每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现核酸提取方法,细胞裂解,细胞裂解可通过以下几种方法实现：,物理作用,化学作用,酶作用,（生物作用）,核酸提取方法,细胞裂解,物理作用：,包括,低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎,等方法这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离超声裂解法提取的核酸片段长度从,20kb,之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般,10kb,核酸提取方法,细胞裂解,化学作用：,变性：,加热、加入表面活性剂,(SDS,、,Triton X-100,、,Tween-20,、,NP-40,、,CTAB,、,sar-cosyl,、,Chelex-100,等,),或,强离子剂,(,异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍,),碱性,p,H,环境：,强碱,(NaOH),或,碱性缓冲液,(TE,、,STE,等,),在一定的,p H,环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离子螯合剂,(EDTA,等,),可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子,Mg2+,、,Ca2+,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。

核酸提取方法,细胞裂解,酶作用（生物作用）：,主要是通过加入,溶菌酶或蛋白酶,(,蛋白酶,K,、植物蛋白酶或链酶蛋白酶,),以使细胞破裂,核酸释放蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖,N-,乙酰葡糖胺和,N-,乙酰胞壁酸残基间的,-(1,4),键水解蛋白酶,K,能催化水解多种多肽键,其在,65,及有,EDTA,、尿素,(1,4mol/L),和去污剂,(0.5%SDS,或,1%Triton X-100),存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率核酸提取方法,酶处理,在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化如在裂解液中加入蛋白酶,(,蛋白酶,K,或链酶蛋白酶,),可以降解蛋白质,灭活核酸酶,(DNase,和,RNase),；,或者加入,DNase,或,RNase,去除不需要的,DNA,或,RNA,核酸提取方法,分离与纯化,酚氯仿法,简介：,1976,，,Stafford,及其同事创立现已经不断改进关键技术：,酚的使用,用酚来分离核酸首先是,Kirty,，,1956,年首次报道当时发现酚可以从水相中抽提蛋白质，使用阴离子盐时，可以实现核酸分配在水相，而蛋白质在有机相。

核酸提取方法,分离与纯化,酚氯仿法,核酸提取方法,分离与纯化,酚氯仿法,酚的准备,重蒸酚,(,去除,可引起磷酸二酯键的断裂及导致,RNA,和,DNA,的交联的醌类氧化物）；,加入,8,一羟基喹咛，以防止酚氧化，（酚氧化发黄，而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联）；,水饱和酚、平衡,PH,（大于,7.8,）（不饱和的酚能与,15%,其提及的水互溶，从而降低水相中核酸产量）,发展和改进：,SDS,取代阴离子盐,酚：氯仿混合液（,增加了对糖、脂的溶解）,异戊醇的使用（,减少泡沫、使,RNase,失活）,核酸提取方法,分离与纯化,酚氯仿法,裂解缓冲液（异硫氰酸胍）处理,蛋白酶,K,消化，（根据需要亦可加入,Dnase,或,RNAase,）,50:48:2,苯酚,:,氯仿,:,异戊醇混合液，与等量的裂解处理液混合，依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀,(,适用于分离小分子量核酸,),或简单颠倒混匀,(,适用于分离高分子量核酸,),后离心分离疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相转移水相，,重复步骤,3,，直至满意为止核酸沉淀,，在含核酸的水相中加入,p H5.0,5.5,终浓度为,0.3M,的,NaAc,或,KAc,后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。

然后加入,2,3,倍体积的预冷的无水乙醇,经一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀14000g,离心,30,分钟,室温，或者如果产量较大可直接用玻璃钩子取出70%,乙醇洗涤,2-3,次，即可将沉淀溶于,TE,保存核酸提取方法,分离与纯化,酚氯仿法,纯度高，,RNA,回收效率极高，尤其是,200,bp,的,RNA,，比如：,siRNA,，,miRNA,，,mRNA,和,tRNA,等,除核酸外，可提取蛋白质,耗时，繁琐，不利于自动化正式名称：异硫氰酸胍,-,酚,-,氯仿核酸提取法,By,Piotr Chomczynski and Nicoletta Sacchi 1987,核酸提取方法,分离与纯化,盐析法,-miller,1,、细胞裂解同前述；,2,、加入,2,体积的,6mol/L,的,NaCl,，与,3,体积的细胞裂解液混合，震荡混匀，,2500rmp,离心,1520min,，此时,DNP,溶解于上清中，蛋白质、,RNA,等位于离心管底部；,3,、小心转移上清，同前步骤用乙醇沉淀法进一步纯化核酸提取方法,分离与纯化,盐析法,-NaAC,1,、细胞裂解同前述；并加入蛋白酶,K,消化,2,、加入,1/10,体积的,3mol/L,的,NaAC,，与,1,体积的细胞裂解液混合，震荡混匀，,-20,孵育,15 min,；台式离心机最大速度离心,1520min,；,3,、小心转移上清，同前步骤用乙醇沉淀法进一步纯化。

核酸提取方法,分离与纯化,盐析法,产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害；,同样不适合大规模自动化提取提取好的,DNA,用蛋白酶处理纯度会提高核酸提取方法,分离与纯化,硅胶吸附法,1,、细胞裂解和酶处理同前述；,2,、处理好的裂解液转入硅胶离心柱，高速离心，利用硅胶可以吸附核酸而不能与其它物质如蛋白质，脂类等结合的特点，洗脱这类杂质；,3,、重复洗涤，提高纯度，最后用核酸洗脱液获得核酸裂解液；洗涤液；洗脱液装入位置,硅胶层,液体流出管道,核酸提取方法,分离与纯化,硅胶吸附法,产量较低，纯度很好；,也能造成大片段核酸的损伤；,对极小片段核酸提取不够好；,简单方便，可进行自动化处理核酸提取方法,分离与纯化,磁性硅胶吸附法,1,、细胞裂解和酶处理同前述；,2,、处理好的裂解液与磁性硅胶颗粒混匀，孵育约,30,分钟，使裂解液中的核酸物质与硅胶粘附；,3,、利用磁力架固定吸附了核酸的硅胶颗粒；吸尽管中的液体，加入洗涤液重复本次步骤,2,次4,、洗脱液收获核酸核酸提取方法,分离与纯化,磁性硅胶吸附法,产量较好，纯度很好；,成本较低，无特殊耗材；,可通过设计特异探针附着于硅胶颗粒，从而可捕获特异物种的核酸成分；,可实现自动化作业。

核酸提取方法,分离与纯化,加热煮沸法,1,、高速离心富集含核酸物质；,2,、加入促细胞裂解的化学物质（,SDS,、,Triton X-100,、,Tween 20,、,NP-40,、,CTAB,、,sar-cosyl,、,Chelex-100,）等,；加入蛋白酶,K,消化一段时间，也可不加，直接,95,以上加热,10,分钟左右；,3,、高速离心，上清中的,DNA,即可用于,PCR,扩增核酸提取方法,分离与纯化,加热煮沸法,只能用于,DNA,提取；一般仅用于血清或体液中病原体,DNA,的提取；,成本最低，临床应用最广；,纯度低，产量低；除了,PCR,外不能直接用于其它分子生物学操作；,纯手工操作，临床,PCR,工作中最易出问题的环节核酸提取方法,分离与纯化,RNA,提取应该注意的问题：,无处不在的,RNase,，比较耐高温，不易失活；,解决的办法：,1,、用于分离,RNA,的耗材，如有可能必须采用高压灭菌；,2,、用于分离,RNA,的试剂尽量采用,DEPC,水配制，（,DEPC,是,RNase,的强烈抑制剂）,3,、操作人员务必佩戴一次性乳胶手套操作,RNA,的提取4,、,RNA,提取体系中,两种著名的,RNA,酶抑制剂,异硫氰酸弧,(GTC),和,-,巯基乙醇,5,、低温离心,核酸提取方法,分离与纯化,其它核酸分离纯化的方法：,1,、玻棒缠绕法；玻璃粉（珠）吸附法；,2,、,甲酰胺解聚法；,3,、离子交换层析；亲和层析法；,4,、密度梯度离心法；,5,、等等,核酸提取方法,分离与纯化,分离纯化方法小结：,产量,纯度,核酸完整性,成本,工时,安全性,酚氯仿,*,*,*,*,*,*,盐析,*,*,*,*,*,*,硅胶柱,*,*,*,*,*,*,磁珠,*,*,*,*,*,*,煮沸法,*,*,*,*,*,*,。