无精子因子及其临床检测的研究进展.doc

无精子因子及其临床检测的研究进展作者：张孝禹，王冬梅单位：烟台山医院牛殖中心，山东烟台【关键词】少精子症；染色体，人,Y；变异（遗传学）；综述无精子因子（AZF）是位于Y染色体长臂、与精子发生相关的一纟II基因或基因簇AZF 在无精子症和严重少精子症的病人中热点缺失，缺失率占不冇男性的&2%［l］o近年来，随 着分子遗传学和辅助生殖技术的不断发展，AZF微缺失的检测日益受到重视，在男性不冇 的诊断和治疗中具有非常重要的意义1Y染色体的结构与分区Y染色体是一种近端着丝粒染色体，由两条染色单体组成，两单体Z间市着丝粒连接，着 丝粒将染色体划分为长臂（Yq）和短臂（Yp）细胞遗传学研究将人类Y染色体分为3个不 同的功能区①拟常染色体区：位于长、短臂的末端，与X染色体的末端属同源区位于 该区的基因，以常染色体基因的方式进行遗传，在男性减数分裂时与X染色体发生交换重 组②常染色质区：由着丝粒、拟常染色体区之外的短骨以及长僭的旁中央区组成有无数 高度重复序列，包括性别决定基因（SRY）和控制精子发生的基因如AZF等③异染色质区： 位于长臂的末端，介于拟常染色体区与常染色质区之间，可被荧光染料染色后发出荧光。

采用染色体显带技术对Y染色体进行区带划分，短臂有1区1带，长臂有1区2带， 分别表示为Ypll、Yqll、Yql2,还可以细分为亚带和亚亚带如Ypll.32、Yqll.23等其中 性别决定基因位于Ypll.3区域，精子发生基因位于Yqll区域还有学者将Y染色体从短臂至长臂人为地分成7个区间，其中短臂分为4个区间，长臂•分 为3个区间［2］性别决定基因位于第1区间，精子发生基因位于第5〜6区间VOGET等 ［3］将Yqll区域划分为25个亚区，即D1〜D25,精子发生基因位于无重叠的D3〜D6、D13〜 D16和D20〜D22亚区2 AZF微缺失的分类和机制1976年,TIEPOLO等［4］首先发现6例无粘子病人存在显微镜下可见的Y染色体长臂远端部 分缺失，这些病人其他方血均表现止常，推测Y染色体长臂远端存在控制精子发牛的基因 山于这些基因的缺失是在无精子病人体内发现的，因此被称为AZFo VOGET等⑸根据AZF 微缺失的发生部位，进一步将Y染色体长臂上控制粘子发生的区域分为AZFa. AZFb、AZFc 3个区AZFa位于Y染色体长臂的第5区间的D3〜D6亚区，长度为1〜3 Mbp,包含USP9Y、 DBY、UTY等基因［6］。

USP 9Y是最早发现的AZFa的候选基因，其编码蛋白是泛素水 解酶，作用在生殖细胞的发育中AZFb位于Y染色体长臂第5〜6区间的近侧端D13〜D16亚区，长度为1〜3 Mbp,包含 RBMY、CDY、XKRY、SMY、elF 1 等基因［7］RBMY 乂名 YRRM,是 AZFb 的最佳候 选基因，编码一个RNA结合蛋白，特异表达在精原细胞和精母细胞AZFc位于Y染色体长皆的邻近异染色质区的D20〜D22亚区,长度为1.5Mbp,僚 DAZ、 PRY、BPY2、TTY2等基凶DAZ为多拷贝棊因，乂称DAZ家族，是AZFc的最佳候选棊 因［8］,编码一个RNA结合蛋白，特异表达在精原细胞和减数分裂早期的生精细胞引起AZF微缺失的原因是DNA的顺向重复序列之间发生了同源重组，从而造成长度 不等的基因片段丢失［9〜11］个体发生AZF微缺失主要有下列两种模式：①遗传性：微缺 失的亲代&nur;微缺失的精子&rair;微缺火的子代；②再发性：止常的亲代→微缺失的精 子、受精卵或早期胚胎&nnr;微缺失子代与X染色体和其他所有的常染色体相比，Y染色体更易发生微缺失，这是因为：①Y染色 体不能像常染色体一样进行DNA修复；②在粘子发生过程中细胞分裂速度快，与卵子发生 过程相比具有更多突变机会；③Y染色体基因都是单倍体，一个基因缺失就能发生效应［12］； ④Y染色体暴露于致突变因素的时间是X染色体或常染色体的2倍，在同样的不利环境中 更易发牛微缺失。

3 AZF的遗传与表型AZF基因在睾丸组织内特异性表达，AZFa、AZFb、AZFc分別主导精子形成过程中的不同 阶段在原发性无精子症或少精子症病人中，可以是单纯的AZFa、AZFb、AZFc区的基因 缺失，也可以是两个以上AZF区域的基凶同吋缺失，另有少部分人（5%）基因的缺失发生 在AZF以外的区域［1］3.1 AZFa 缺失较为罕见，大约占1%〜5%可导致青春期精子发生阻滞，表现为单纯的唯支持细胞综合 征（SCOS）,睾丸组织检查示生精1二皮细胞缺乏，无精原细胞岀现临床表现为小睾丸症, 75%为无精子症，25%为严重少精子症3.2 AZFb 缺失缺失率在16%左右可导致青春期减数分裂前或减数分裂期间粘子发生阻滞，表现为减数 分裂前的生粘细胞正常，而减数分裂后的生精细胞缺乏，病人的睾丸活检可见精原细胞和初 级精母细胞，但没有精子生成AZFb全部缺失时，临床表现为无精子症；部分缺失时，可 表现为无精子症或严重的少精子症3.3AZFC 缺失是男性不冇症病人中最常见的Y染色体微缺失，发生率为60%o睾丸组织学表现呈多样化, 可有精原细胞并见有限的精子牛成，也可以见到精子发牛停滞丁•不同阶段的牛精上皮细胞。

病人出现无精子症和少精子症的不同临床表现有的病人表现为精子计数止常，但多伴有精 子形态异常有少数病例虽然有了子代，而子代木身同样是AZFc位点缺失者，也己经证实 其为无精子症者由此看来，AZFc缺失者可以有不同的临床表现［13］3.4两个以上的AZFlx同时缺失发生率为14%o可以是AZFa+c、AZFb+c或AZFa+b+c的缺失，其中AZFb+c的缺失最为 频繁，临床上表现为更加严重的精子牛成障碍4AZF微缺失的检测AZF微缺失在光学显微镜下难以分辨，提取外周血基因组的DNA,采川多重PCR技术， 对选定的Y染色体序列标签位点（STSs）设计多对引物进行扩增，则较容易判断检岀AZF区 域的微缺失，这是当今检测男性生精障碍的一项重要的分子生物学技术Y染色体上有许多的序列标签位点，AZF的STSs图谱至今已更新过数次STSs缺失 在不同的地区、不同的种族间存在着差异每个实验室选用的STSs不同，AZF缺失的检出 率有很人的差异比较有代表性的STSs在AZFa区主要是SY84、SY86,在AZFb区主要 是SY127、SY134,在AZFc区主要是SY254、SY255等欧洲分子生物学实验室己经制定 了统一的标准，选定6个STSs作为欧洲Y染色体AZF微缺失筛查的位点［14］。

没有资料支 持选择的STSs越多，AZF微缺失的发牛率就越高，反而增加实验室的工作暈，影响检测效 果但是选择的STSs位点越多，尤其是包括了特异于AZF区域的位点及其邻近和远端的位 点，AZF诊断的特异性和墩感性可能会明显提高AZF检测的准确性一直是学者关注的重点，应注意操作的每一个步骤，要设置适当的对照 川蒸馅水作空白对照，以检测试剂是否被污染川正常生育的男性与女性做阳性或阴性对照, 以排除假阳性的町能用性别决定基因（SRY）和XY染色体共有的锌脂蛋口基因（ZFX/ZFY） 作为内対照在提取DNA时要提高纯度，避免假阴性选择合适的引物序列、提高扩增产 物的分子质量的差值，可以改善AZF的检测效果对于可疑的AZF缺失的病人，应重复检 测2〜3次5 AZF微缺失检测的临床意义引起男性不育的原因很多，由粘索静脉1111张、隐睾、生殖系统感染、内分泌紊乱、免疫反 应异常等原因造成的男性不育可以通过手术治疗或药物治疗的方式解决，由遗传缺陷引起的 精子发生障碍的病人，药物治疗没有任何效果，而这部分病人在男性不育中占有很大比例 有资料衣明，AZF微缺失在精索静脉曲张、隐睾等病人中的检出率明显升高，如果不明确 此类不冇人群是否合并有遗传凶索，手术和药物治疗的效杲是很有限的[6]。

因此，检测Y 染色体AZF微缺失，明确精子生成障碍的真正原因，可以避免不必要的药物或手术治疗目前，对无精子症和严重少精子症病人生冇的有效治疗方法是卵细胞浆内单精子注射 术(ICSI)精子的来源可以是精液中排出的少量精子，也对以是睾丸细针穿刺术(TESA) 或经皮附睾穿刺抽吸取精术(PESA)获得的精子[15]巾于失去了口然选择的屏障作用，受孕 的精子可能是带有AZF微缺失的精子，这样就人为地把基因缺陷遗传给男性子代带有Y 染色体微缺失的精子，其胚胎的种植率与止常精子相比是否有差别，目前还存在着一些相互 矛盾的结果，但胚胎植入前遗传学诊断技术(PGD)可以筛查AZF微缺失，通过选择女胚 植入而终止缺陷基因传递的途径睾丸穿刺収精具有很大的侵袭性，而且大约50%的非换阻性无精子症的病人睾丸穿刺不能 获得精子为了减少病人穿刺取精时的痛苦、降低配偶术前所要经历的卵泡促排和穿刺取卵 的负担，有必要提前对睾丸収精的可行性进行有意义的评估尽管AZF微缺失的遗传与表 型之间的关系没有最终确定，但己冇很多资料表明，AZFa或AZFb完全缺失的病人，睾丸 穿刺获得精子的可能性儿乎为零，没有必要行睾丸穿刺[5]。

只有一部分AZFc缺失的无精子 症病人，睾丸穿刺可能获得成熟的精子AZF微缺火的种类与个体精液从少精子至严重少精子、直至无精子的进展有关有学 者对91例Y染色体微缺失者的男性近亲(父或兄弟)进行筛查，5例AZFc微缺失的父亲 将棊因缺陷传给儿子，这表明Y染色体微缺失者的精子生成可随吋间而改变[16]o对于少精 子症的病人，预先明确其AZF缺失的基因型，随时了解其精子质量特别是精子数量随时间 变化的情况，提前冷冻保存粘子以备将来之需，不失为一种明智的选择参考文献】11JFORESTA C. Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis[JJ. Endocr Rev, 2001,22:2262 2391. [2]LAHN B T, PAGE D C. Functional coherence ofthe human Y chromosome [J]. Science, 1997,278(24):675 679. [3]VOGET P H. Humanchromosome deletion in Yql 1, AZF candidate genes and male infertility:history and updatefJ]. Mol Hum Reprod, 1998,4:739 744. [4]TIEPOLO L, ZUFFARDI O. Localization offactors controlling spermatogenesis in the non fluoresce nt portion of the human Y chromosome long arm[J]. Hum Genet, 1976,34(2):119 124. [5]VOGET P H, EDDMAN A, K1RSH S,et al. Human Y chromosome azoospermia factors mapped to different subregions in Yqll[J]. Hum Mol Genet, 1996,5(7):933 936. [6JKUNEJ T, ZORN B, PETERLIN B. Y chromosomemicrodeletions in infertile men with cryptorchidesm[J]. Fertil Steril, 2003,79:1559 I565.[7JFERLIN A, M。