细菌原生质体融合实验.docx

细菌原生质体融合实验实验菌株1、枯草杆菌(B.Subtilis) Ki-2-132 StrrRifs枯草杆菌(B.Subtilis) ASL-1098 StrsRifr二、 实验材料1、 器皿：三角瓶、离心管、试管、平皿、吸管、牙签、滤纸、玻璃棒等2、 仪器：摇床、恒温箱、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计、显微镜等三、 试剂与培养基1、 HM 液(1000mL)配方：NHCl 1g； Tris 12g； KCl 0.035g； NaCl 0.05g； NaS^ - 10HO 0.3g； MgCl -5HO4.26g；蔗糖 171g 4 2 2调节pH=7.5，另加以血清制剂2、 HMD每 1mLHM 液含 DNase 10四g3、 CM配方：牛肉膏0.5%；酵母膏0.5%； NaCl 0.5%；蛋白酶1%；葡萄糖0.5%调节 pH=7.24、 DM3配方：琥珀酸钠90.05g；水解乳蛋白5g；葡萄糖5g；酵母膏5g； MgC" ・H2O 4.66g；K2HPO4 3.5g;KH『O4 1.5g 2 25、 其他4 2 40.85% NaCl； 0.5M 蔗糖液；40%PEG四、 操作步骤(一) 原生质体制备1、 分别从活化的菌种斜面取2环，接于30mL/100mL的CM液中，摇床培养至OD570至0.86-0.9；2、 以0.2%的接种量转接于200mL/500mL的CM液中，37°C振荡培养5小时；3、 当OD570达到0.4时① 稀释、活菌计数② 5x10mL 3500rpm离心收集菌体，用HM数量悬浮并洗涤1-2次，弃上清。

用10mLHM 液将5管菌体悬浮液倒入盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，震荡10分钟，使菌体分散均 匀先吸取0.1mL做系列稀释，做酶解前计数4、 无菌称量2.5mg，2.0mg溶菌酶加入三角瓶中，温和震荡35分钟，再置于42C水 浴锅中保温酶解20分钟；5、 用接种环取样以0.5M蔗糖液稀释涂片、美兰染色、镜检若干视野，计算原生质体的制备率同时取0.5mL原生质体稀释置于4.5mL无菌 中，裂解20分钟后，系列稀释做裂解计数，计算原生质体制备率二) 原生质体再生1、取酶解后的原生质体液5mL置于无菌离心管中，以3500rpm离心15min，收集原生 质体，去掉酶液2、 用少量DM液悬浮，离心洗涤一次，最后用5mL DM液再悬浮，做成原生质体悬液3、 将上述原生质体悬液用DM3做系列稀释，取0.5mL样加入0.5mL枯草杆菌细胞壁的 碎片制剂，加4mL DM半固体：混匀后倾注于DM底层平皿上再生4、 37°C培养48-72时后，计数再生平皿上长出的菌落，计算再生率再生率=［再生平皿上算得的总菌落数-活菌计数x （1-制备率）］/活菌总数x制备率（三）原生质体融合与再生1、 取2环菌株的上述原生质体悬浮液各1mL，混合离心收集原生质体，悬浮于0.2mLHMD中；2、 加入 1.8mL40%PEG （6000），置于 4C冷水 1-2min；3、 立即加入3倍体积的HMD （6mL），轻轻摇匀，再按3500-4000rpm离心15min，弃 上清。

4、 以2mL DM液悬浮，并做系列稀释5、 同（二）分别用双层培养法，倾注于DM平皿或同时含有两种抗菌药物的DM底层平皿上37C正置培养48-72小时后分别计数再生的菌落 3（四）融合子的检出将上述每新株原生质体，景荣和诱导剂处理后，在含两种抗菌药物（链霉素与利福平）的DM在大平皿上长出的菌落绝大多数是融合子。