《异基因造血干细胞移植后人类疱疹病毒6型感染及其与巨细胞病毒感染的相关性》.docx

异基因造血干细胞移植后人类疱疹病毒6型感染及其与巨细胞病毒感染的相关性【摘要】 为了解人类疱疹病毒6型在中国接受异基因造血干细胞移植的人 群中感染现状及其与巨细胞病毒感染的相 关性，对72例接受HSCT勺患者HHV-6 DNA 血症进行连续监测收集 HSC德者移植前 和移植后1-12周EDTAS凝的外周血标本共 680份，采用巢式聚合酶链反应检测外周血 单个核细胞中HHV-6DNA并利用Hind m限 制性内切酶对HHV-6进行基因分型，同时采 用免疫荧光法检测 CMM原血症结果显示， HSC而咖勺患者至少1次出现HHV-6 DNAM 症，首次检出的中位时间为 14天；除1例 患者检出HHV-6濯以外，其余所有 HHV-6 阳性患者均为HHV-6哩感染％勺移植后患 者至少1次发生CM成原血症，首次检出的 中位时间为43天HHV-6与CMV^感染的发 生率为％ HHV-6DNA血症的首次检出时间早于CM\B原血症HHV-6 DNA血症阳性患者CMW原血症检出率显着高于 HHV-6血症阴性患者:%(38/45) vs %(9/27), P=]HSCT后的疱疹病毒感染相关疾病中出血性膀胱 炎发生率较高:% (17/72)],其中％勺HC发生于HHV-6血症阳性患者，％发生于 染以及HHV-6与CMVft感染状态普遍存在， 且发生于移植后早期的 HHV-6感染与发生时 间相对较晚的CM通染之间可能存在相关性。

CMV+/HHV-6患者结论:HSC后 HHV-6感【关键词】造血干细胞移植；人类疱疹病毒6型；巨细胞病毒Prevalence of Human Herpesvirus-6 in Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant Recipients in Correlation with Cytomegalovirus InfectionAbstract In order to study the prevalence of humanherpesvirus 6 (HHV-6) in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (allo-HSCT) recipients in China and to analyze the relationship between HHV-6and cytomegalovirus (CMV) infection in post-HSCT patients, nested polymerase chain reaction (PCR) was used to monitor HHV-6 DNAemia in 72 consecutive allo-HSCT recipients. 680 EDTA anticoagulated peripheral blood specimens were gathered before HSCT or weekly until 12 weeks after allo-HSCT.The variants of HHV-6 were identified by Hind HI restriction analysis. CMV -pp65 antigenemia was detected immunofluresence stain. The resultsshowed that HHV-6 DNAemia was detected at least once in % (45/72) of the patients on the median day 14 (range, 7-63 days) after allo-HSCT, and HHV-6B was the predominant variant. CMV antigenemia was detected at least once in % (47/72) of the patients on the median day 43 (range, 14-105 days) after allo-HSCT. Co-infection of HHV-6 and CMV (HHV-6+/CMV+) occurred in % (38/72) recipients. The onset of HHV-6 DNAemia was earlier than that of CMMntigenemia ().Patients with HHV-6 DNAemiapositive were more likely to have concurrent CMV antigenemia than HHV-6 DNAemianegative patients (% vs %, P=) after allo-HSCT. Among the herpesvirus related disease, the relatively high incidence of hemorrhage cystitis (HC) occurred in % (17/72) of post-HSCT patients. %(15/17) of HC developed in HHV-6 positive patients , and % (14/17) occurred in CMV+/HHV-6+ patients. It is concluded that infection of HHV-6, co-infection of HHV-6 and CMV, commonly occurred in post-HSCT patients in China, HHV-6 infection closely related to CMV antigenemia.Key wordshematopoietic stem cell transplantation; human herpesvirus 6; cytomegalovirus人类疱疹病毒6型与巨细胞病毒同属于 3疱疹病毒亚家族。

根据基因组多态性，HHV-6可以分为A、B两个变异型，其中以 HHV-6B^最为常见，其原发感染多见于2岁 以内的儿童，是幼儿急疹的主要原因，在 2岁以上人群中的血清抗体检出率达到 90%以上[1]HHV-6以CD46分子为受体感染细胞[2],由于CD46广泛分布于唾液腺、淋巴 组织、血管系统、肾脏以及中枢神经系统的 神经胶质细胞，在HHV-6宿主细胞范围内分 布也相对广泛除了主要对 CD4+T细胞具有 亲嗜性以外:3], HHV-6还对单核细胞、唾 液腺细胞、NK细胞、脑组织的少突胶质细胞、 星状细胞:4]等具有亲嗜性与疱疹病毒 家族的其他成员相同，原发感染后HHV-6在 宿主体内长期处于潜伏状态，当宿主免疫被 抑制后，如造血干细胞移植，体内潜伏的 HHV-6可以再活化大量研究结果提示，CMV 感染及其合并症是影响 HSCTt者预后的重 要原因，因此临床上对移植后 CMV染的防 治相当重视，但是 HHV-6的研究历史较短， 对其在HSCTt者体内的致病过程尚未得到 足够认识新近国外报道，HSC诟40%-50% 患者出现HHV-6感染[5],与HSCTt中枢神经系统合并症:6］、间质性肺炎:7］、骨 髓抑制［8］等的发生可能存在相关性。

HHV-6 与CM雁基因序列上有高度同源性，因而在 生物学特性方面也存在很多共性Razonable等［9］发现在实体器官移植中， 常常发生 HHV-6与CM而时感染Chapenko 等［10］认为，与HHV-6同源性更近的另一 3疱疹病毒家族成员HHV-7和CM观感染是 增加肾移植患者“ CMV病”发生率的危险因 素HSC诟HHV-6感染及其与CM德染的关 系国内尚无相关报道 本研究应用巢式聚合 酶链反应和免疫荧光法分别监测 HSCTfHHV-6和CM通染，并分析HHV-6感染与 CMV 感染以及疱疹病毒感染相关疾病的关系材料和方法患者特征及样本采集2004年5月至2005年6月接受HSCT勺 患者共72例收集患者移植前和移植后 1-12 周EDTAK凝的外周血样本共680份患者 特征为：男性41例，女性31例，中位年龄 岁；急性髓性白血病19例，急性淋巴细胞 白血病16例，慢性粒细胞白血病 22例，非霍奇金淋巴瘤6例，骨髓增生异常综合征 4 例，再生障碍性贫血2例，急性早幼粒细胞 白血病、多发性骨髓瘤和急性混合细胞白血 病各1例HLA配型相合亲缘供者 HSCT 25 例，HLA配型相合非血缘 HSCT4例，HLA部 分相合亲缘供者 HSCT43例。

对HLA配型相 合亲缘供者HSCTt者给予马利兰加环磷酰 胺为主的改良BU/CY方案或分次全身照射加 环磷酰胺方案预处理； 非血缘或HLA部分相 合HSCT患者给予含抗胸腺细胞球蛋白的预 处理方案移植物抗宿主病预防方案为环抱 菌素A、霉酚酸酯联合短疗程氨甲喋吟所 有患者在预处理期间静脉应用更昔洛韦 5mg/kg,每12小时1次，移植当天至移植 60 天以后每天给予阿昔洛韦 g,预防病毒感染 对CM晰原血症阳性或出现间质性肺炎、 出血性膀胱炎和胃肠炎等疱疹病毒感染相关 疾病的患者给予更昔洛韦或磷甲酸干预性 治疗治疗急性GVH晚要应用糖皮质激素 将采集的外周血样本经裂解红细胞后获得 外周血单个核细胞，应用全血基因组DNAI 取试剂盒提取基因组DNA用紫外分光光度 计测定DN缺度，然后-40C保存HHV-6 DN成症的巢式PCRlt测 巢式PCR引物:11 ］扩增HHV-6 U31基因片段HHV-6外引物序列：5 -TTAACGGTCGCGTTCTA ACC-,和 5 -ACGCCTCGTTGAATACTTCG3曾产物为 1 216 bp片段；内引物序列：5 -AAGAAGG CTATCACTTAGACACG G-和5 -TTAGGATAAG AAGCTCGGCG-扩增产 物为492 bp片段。

PC版应体系为50从l , 含 10X PCR buffer (Mg2+) , mol/L dNTP , 10从mol/L上、下游引物， U r-Taq DNA 聚合酶，100 ng模板DNA第一轮PC版应 条件：94 C预变性3分钟；94C变性30秒； 55C退火30秒；72C延伸60秒；35个循环 后72C后延伸7分钟第二轮PC板应条件： 以2 l第一次反应产物为模板，反应条件 同第一次反应扩增产物 2%琼脂糖凝胶电 泳，EB染色，紫外灯下检测每一次巢式 PC板应均设立不含模板的阴性对照，同时 以含有HHV-6目的片段的质粒为阳性对照阳性标准品构建和巢式 PC板应敏感性检测将巢式PCRI一次反应扩增阳性片段回 收后与PMD-18载体连接，转化 DH5a感受 态大肠杆菌，经菌液PCR^质粒酶切双重鉴 定的含有目的片段的菌液送北京诺赛基因 中心测序，序列与 GenBank公布序列一致， 则将所提取的质粒作为本实验的阳性标准 品将阳性标准品由高浓度 108/ 11 l至 101/(1 l依次10倍稀释后，继续稀释至 5 copies/ (11 和 1 copy/ 从 l ,取 1 从 l 作为 PCR莫板检测PC版应的敏感性。

限制性酶切HHV-6 PCRT物分型HHV-6B型PCRT增产物片段上含有Hind m 酶切位点，可以产生 370和122 bp 的两个片段，HHV-6A型扩增产物片段上则不 含Hind m酶切位点酶切反应体系20 l , 含 HHV-6 阳性 PCRT物 4 p l , Hind m 内 切酶5 U , 37C酶切1小时后，酶切产物经 2。