复合型非病毒载体的构建及其生物学性能研究.pdf

辽宁师范大学 硕士学位论文 复合型非病毒载体的构建及其生物学性能研究 姓名：郝晓敏 申请学位级别：硕士 专业：动物细胞 指导教师：金梅 20100401 辽宁师范大学硕士学位论文 - I - 摘 要 阳离子脂质体对阴离子型聚电解质阴离子敏感,对带负电荷的DNA有较高的转运能 力,还能转运RNA、 核糖体及其他大电荷的分子和大分子物质进入细胞,其转染效率比其 它脂质体高出许多倍，因而被广泛应用于基因转移技术中但是阳离子脂质体与病毒载 体相比，具有转运效率较低，细胞毒性大等缺点本课题在合成的阳离子类脂中加入不 同助剂制备成新型的复合型非病毒基因载体，以期提高转运效率，降低细胞毒性 本实验从复合型非病毒载体的物化性质与生物性能两个方面研究复合型非病毒载 体以及它与DAN的复合物的结构、粒径、表面形态等与转运效率、细胞毒性的关系，以 便为提高转运效率提供研究依据 主要包括琼脂糖凝胶电泳分析复合物型非病毒载体与 质粒pGFP-N2（报告基因）DNA的结合能力，以商品试剂 Lipofectamine2000和DOTAP 为对照，利用脂质体/DNA复合物转染Hep-2细胞，荧光显微镜观察其基因转染效率, 利 用MTT法评价转染试剂的毒性。

琼脂糖凝胶电泳结果表明：在阳离子脂质体中加入少量或等量DOPE，延滞DNA能 力增强，DOPE量多时反而减弱；用蔗糖酯修饰的阳离子脂质体延滞能力变化不明显； 加入壳聚糖脂质体，延滞DNA的能力明显增强原子力显微镜结果显示，阳离子脂质体 在云母片上形成的颗粒为球形或椭圆形，粒径分布较为均匀；阳离子脂质体/DNA复合物 在云母片上的颗粒形状不规则，粒径分布不均且比空白脂质体的粒径大壳聚糖修饰的 脂质体/DNA复合物的粒径变大，形状更加的不规则加入蔗糖酯与DOPE后，转染效率 升高；壳聚糖修饰的脂质体转染效率明显提高但MTT毒性显示，加入DOPE与壳聚糖的 脂质体毒性降低，而加入蔗糖酯的脂质体毒性增高 关键词关键词：阳离子脂质体；转染效率；原子力显微镜；助剂 复合型非病毒载体的构建与其生物学性能研究 - II - The Synthesized Of Complex Non-viral Vecor And The Study Of Its Biological Properties Abstract Cationic liposomes is sensitive for anionic polyelectrolyte anion.It can transfer charged DNA into cells high negatively but also transfer RNA, ribosomal, large charged molecules and other macromolecules. The transfection efficiency is many times higher than other lioosomes. However, The transfection efficiency of cationic liposomes, compared with the viral vector, is less efficient, and it has cell cytotoxicity. Cationic lipids synthesized by our group were prepared into liposomes with different additives. The ability of complexing of liposomes and pDNA were analyzed. The transfection efficiency and cell cytotoxicity in vitro are studied. Cationic liposomes were prepared by thin-film ultrasonic technique. The condensation of plasmid DNA (pGFP-N2) was studied through agarose gel electrophoresis and the morphology was analyzed by atomic force microscope (AFM). The transfection efficiency of lipoplex of Hep-2 cells was obtained based on green fluorescent protein (GFP) expression by inverted fluorescent microscopy using lipofectamine2000 and DOTAP as contrast. Transfection conditions were optimized and the cell toxicity was evaluated using MTT assay. The complexing ability was enhanced by adding little or equimolar DOPE, but descend. The complexing ability is no change by adding sucrose ester and increased obsviously after adding chitosan. chitosan. Transfection efficiency was decreased after adding sucrose ester, increased after adding DOPE and can increased obsviously after adding chitosan. After vacuum drying we could observe the appearance of the sample particles by atomic force microscopy. Cationic liposomes formed in the mica particles were spherical or oval shape, and their distribution was more uniform; cationic liposome /DNA complexes on mica particles were irregular shape, their distribution was uneven and larger compared with blank liposomes. Chitosan-modified liposome / DNA complexes particle size become larger, and the shape is more irregular. Adding sucrose ester and DOPE, the transfection efficiency become higher; the transfection efficiency of chitosan-modified liposome has improved significantly. But the MTT Cytotoxicity has shown that adding DOPE and chitosan into liposomes reduced Cytotoxicity, while adding sucrose esters liposomes increased Cytotoxicity. 辽宁师范大学硕士学位论文 - III - Key Words：：Cationic Liosomes；Transfection Efficiency；AFM;；Additives 学位论文独创性声明学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。

论文中除特别加以标注和 致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意 学位论文作者签名： 学位论文版权的使用授权书学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后使用本授权书 学位论文作者签名： 指导教师签名： 签名日期： 年 月 日 辽宁师范大学硕士学位论文 - 1 - 引 言 基因治疗是通过合适的载体将目的基因转运到患者特定的组织细胞（靶细胞）内进 行适当的表达，以纠正或改善该基因所产生的缺陷，达到治疗疾病的目的，其有效性已 得到验证。

在将外源基因引入细胞的过程中,DNA 会被体内的核酸酶降解,在未进入靶细 胞,甚至未达到靶器官时便降解成小分子核苷酸,从而失去治疗作用 为了在体内运输过 程中更好地保护治疗基因,可以将其与基因载体结合,一个合格的基因载体是基因治疗 成功的有力保障 因此,基因载体的开发对基因治疗的发展尤为重要,它的有效开发将推 动基因治疗向常规治疗方法的转变 目前基因载体一般分为病毒载体与非病毒载体两大 类病毒载体转染效率高，靶向性好，但可控性弱，DNA装载量有限，载体组装难度大， 具有潜在的致癌性和自身的免疫性非病毒载体作为一种新型的转运系统，具有病毒载 体无法比拟的优点，它低毒、低免疫原性、外源基因整合概率低、无基因插入片段大小 限制、使用简单、制备方便、易于生产、便于保存和检验 脂质体在所有已用于临床试验的基因载体中仅次于病毒载体居第二位,是最有发展 前景的非病毒载体脂质体是磷脂分散在水相形成的一个类球状的、包封一部分水相的 封闭囊泡早期研究的天然磷脂形成的脂质体虽具有生物分解性好，目标指向性优良的 特征，但在一定程度上又受到其化学结构的制约，化学及物理性能不够稳定在多种类 型的脂质体(如阴离子脂质体、 免疫脂质体、 pH 敏感脂质体、 空间稳定化脂质体等) 中, 由于阳离子脂质体对阴离子型聚电解质阴离子敏感,对带负电荷的DNA 有较高的转运能 力,还能转运RNA、核糖体及其他大电荷的分子和大分子物质进入细胞,其转染效率比其 它脂质体高出许多倍。

由于阳离子脂质体具有一定的细胞毒性， 因此很多研究都利用在脂质体中添加助剂 来提高转运效率，降低细胞毒性作为脂质体助剂的主要有 DOPE、壳聚糖与蔗糖酯等 DOPE 是应用最广的中性磷脂， 它可以稳定双层膜并降低阳离子脂质体毒性， 同时帮助阳 离子脂质进入细胞蔗糖酯因为具有亲水和亲油两性特性，并且毒性很低，因而被经常 用于药物领域壳聚糖是一种阳离子天然高分子聚合物，它价格较低、生物相容性好、 可降解、低毒的因为壳聚糖带有正电荷，所以易与 DNA 结合，形成聚电解质复合体， 使 DNA 具有更强的抵抗核酸酶降解的能力因此将上述的物质（DOPE、蔗糖酯、壳聚糖） 作为助剂加入到普通脂质体中或进行脂质体的修饰，以期提高转效率、增加稳定性，。