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现代分子生物学 复习内容 现代分子生物学 复习内容一、DNA的变性〔Denaturation〕：指DNA分子由稳定的双螺旋构造松解为无规那么线性构造的现象准确地就是维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂断裂可以是局部的或全部的，是可逆的或是非可逆的DNA变性不涉及到其一级构造的变更1. DNA变形的条件：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可破坏双螺旋构造引起核酸分子变性 2. DNA变性后发生的改变：DNA变性后原来隐藏在双螺旋内部的发色基团，成为单链而暴露出来，使DNA的物理和化学性质发生一些列的改变，这些改变包括：〔1〕DNA溶液的浓度大大下降DNA双螺旋是严密的\刚性\构造,变性后代之以“松软” 而松散的无规那么单股线性构造，DNA粘度因此而明显下降〔2〕溶液旋光性发生变更变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性变更, 使DNA溶液的旋光性发生改变〔3〕增色效应或高色效应(hyperchromic effect)DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外汲取的构造根底,但双螺旋构造有序积累的碱基又“束缚”了这种作用。

变性DNA 的双链解开,碱基中电子的相互作用更有利于紫外汲取,故而产生增色效应 〔4〕生物活性丢失 〔5〕浮力密度上升3. 引起DNA变性的主要因素： 〔1〕加热〔生理温度以上〕加热使DNA变性后，在260nm处的紫外汲取值明显上升，一般当DNA加热时，在260nm汲取值先缓慢上升，到达某一温度后又蓦然上升，其特点是爆发式的，变性发生的范围很窄，其相变过程用Tm值描述〔2〕极端pH值当pH为12时，碱基上的酮基变为烯醇基，影响氢键形成，从而变更Tm值，当pH为2～3时，碱基上的氨基发生质子化，也影响氢键形成〔3〕有机溶剂、尿素和酰胺等当环境中存在酰胺或尿素时，它们可与DNA分子中的碱基形成氢键，从而使DNA分子保持单链状态，以利于分子克隆的操作 4. Tm值大小的影响因素：〔1〕DNA的均一性有二种含义，首先是指DNA分子中碱基组成的均一性,如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段,与自然DNA比拟,其Tm值范围就较窄其次还包含有待测样品DNA的组成是否均一的意思,如样品中只含有一种病毒DNA,其Tm值范围较窄, 假设混杂有其它来源的DNA,那么Tm值范围较宽〔2〕DNA的(G+C)含量。

在溶剂固定的前提下，Tm值的凹凸取决于DNA分子中的(G+C)的含量G+C)含量越高,即G-C碱基对越多,Tm值越高〔3〕介质中离子强度：DNA在离子强度较低度介质中Tm值较低，范围较宽；在高离子强度时，DNA的Tm值较高，范围较小所以DNA在含盐的缓冲溶液中较为稳定 二、DNA的复性〔renaturation〕：指变性DNA 在适当条件下, 二条互补链全部或局部复原到自然双螺旋构造的现象,它是变性的一种逆转过程热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为\退火\ 1. DNA复性的条件：〔1〕必须的离子强度：用以减弱两条链中磷酸基团之间的排斥力，通常用0.2－0.5M NaCl 〔2〕较高的温度：幸免形成无规那么氢键，但是不能太高，否那么不能形成有规那么氢键以维持双链构造2. 影响DNA复性的因素：〔1〕DNA分子的困难程度DNA序列越困难，复性越慢，所需时间越长〔2〕DNA的浓度同一种DNA分子，浓度越高，互补链碰撞时机越多，复性越快〔3〕DNA片段大小DNA片段越大，复性越慢，因此，在复性探究时，一般要将其剪切成400bp大小的片段，以增加复性速度〔4〕温度复性速度与温度干脆有关，温度不宜过低，一般在Tm=25℃ 〔5〕阳离子浓度。

在小于0.5mol/L浓度时增加盐浓度有利于复性 三、基因1.基因的顺反子概念：现代分子生物学文献中，顺反子和基因这两个术语相互通用一般而言，一个顺反子就是一个基因，1500～2000个核苷酸，它是由一群突变单位和重组单位组成的线性构造〔因为任何一个基因都是突变体或重组体〕有构造基因与调控基因的划分，还有重叠基因和断裂基因的发觉 2. 基因重叠的方式：〔1〕大基因内包含小基因 〔2〕前后两基因首尾重叠 〔3〕三个基因之间重叠 四、基因组1. 基因组的概念：基因组是指细胞内遗传信息的携带者-DNA的总体基因组中不同的区域具有不同的功能，有些是编码蛋白质的构造基因，有些是复制及转录的调控信号，有些区域的功能尚不清晰基因组构造是指不同功能区域在整个DNA分子中的分布状况 2. 细菌染色体基因组构造的一般特点：〔1〕通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域为类核只有一个复制起始点〔2〕具有操纵子构造，其中的构造基因为多顺反子，即数个功能相关的构造基因串联在一起，受同一个调整区的调整〔3〕在大多数状况下，构造基因都是单拷贝，但是编码rRNA的基因往往是多拷贝的。

〔4〕不编码的DNA部份所占比例比真核细胞基因组少得多 〔5〕具有编码同工酶的基因〔6〕在细菌中编码依次一般不会重叠，即不会出现基因重叠现象〔7〕在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC，复制终止区TerC，转录启动区和终止区等3. 真核生物基因组有以下特点：〔1〕真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的，即有两份同源的基因组〔2〕真核细胞基因转录产物为单顺反子一个构造基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链〔3〕存在重复序列，重复次数可达百万次以上 〔4〕基因组中不编码的区域多于编码区域〔5〕大局部基因含有内含子，因此，基因是不连续的〔6〕基因组远远大于原核生物的基因组，具有很多复制起点，而每个复制子的长度较小 4. 真核生物基因组与原核生物基因组特点比拟：〔1〕真核生物的基因组远大于原核生物基因组，具有相当的困难度 〔2〕基因组中非编码区远远多于编码区〔3〕基因组中的DNA与蛋白质结合，形成染色体存在于细胞核内 〔4〕大局部基因有内含子，因此基因的编码区域不连续 〔5〕存在着重复序列，重复次数从几次到几百万次不等。

〔6〕基因组中以多复制起点的形式复制〔7〕转录产物为单顺反子〔8〕真核基因与原核基因一样，也存在着可移动的因子 5. 基因家族的特点：〔1〕基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇或串联重复基因 〔2〕有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上〔3〕有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因成为假基因 6. 假基因无表达活性的缘由：〔1〕缺乏有功能的调控区，使其不能进展正常转录〔2〕即使能转录，由于突变或缺失等引起mRNA加工缺陷 〔3〕使mRNA翻译提前终止 〔4〕产生无功能的肽链 五、DNA复制1. DNA 复制的起点：原核，单起点；真核，多起点2. 半保存复制试验证据：1958年，Meselson和Stahl利用同位素标记和密度梯度离心试验，将大肠杆菌放在15NH4Cl造就基中生长15代，使DNA被15N标记后，再将细菌移到只含有14NH4Cl的造就基中造就分别取0代、1代、2代、3代的细胞，提取DNA，进展密度梯度离心结果发觉：当含有15N-DNA的细胞在14NH4Cl造就液中造就一代后，只有一条区带介于14N-DNA与15N-DNA之间，说明DNA一条链来自15N-DNA，另一条链为含有14N的新合成链；造就两代后那么出现两条带，一条带在14N-DNA区，另一条带在14N-DNA和15N-DNA之间，遵照半保存复制方式造就两代，只能出现14N-DNA和14N，15N-DNA两种分子；造就三代后那么出现三条带，一条带在14N-DNA区，一条带在14N-DNA和15N-DNA之间，还有一条带在15N-DNA区，遵照半保存复制方式造就三代，能出现14N-DNA、14N，15N-DNA和15N-DNA三种分子；随着代数的增加14N-DNA渐渐增加，而14N，15N-DNA区带渐渐减弱。

3. DNA复制的几种主要方式：〔1〕线性DNA双链的复制：复制叉生长方式有单一起点的单向〔如腺病毒〕及双向〔如T7噬菌体〕和多个起始点的双向几种DNA双向复制时，复制叉处呈“眼”型，因为确定的DNA聚合酶和RNA聚合酶都只能从5’端向3’端移动〔2〕环状DNA双链的复制：环状双链DNA的复制可分为型、滚环形和D-环形几种类型 a. 型：环状DNA可以采纳此种典型的DNA复制方式进展复制，即从复制起点起先，双向同时进展，形成θ样中间物，故又称θ型复制，最终两个复制方向相遇而终止复制这种复制形式从E.coli的3H胸腺嘧啶核苷酸造就物和放射自显影结果得到了证明 b. 滚环型〔rolling circle〕：这是单向复制的一种特别方式滚环复制在噬菌体中是很常见的，如Φx174的双链环状DNA复制型〔RF〕就是以这种方式复制的这种复制方式的特点是以一条环状单链DNA为模板，进展新的DNA环状分子合成 c. D-环型〔D-loop〕：也是单向复制的一种特别方式这种方式首先在动物线粒体DNA的复制中被发觉，双链环在固定点解开进展复制，但两条链的合成高度不对称，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代。

叶绿体DNA的复制也采纳D环的方式 六、参加DNA复制的酶1. DNA聚合酶：以DNA为模板的DNA聚合酶，以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物，反响须要有模板的指导和3’-OH存在，DNA链的合成方向为5’→3’ 2. 原核生物〔大肠杆菌〕中的DNA聚合酶 比拟工程 构造基因 相对分子质量 DNA聚合酶Ⅰ pol A 103000 DNA聚合酶Ⅱ Pol B 88000 DNA聚合酶Ⅲ Pol C 830000 3’→5’外切核酸酶 5’→3’外切核酸酶 功能 + + 切除引物，修复 + - 2400 修复 功能 + - 15000～60000 复制 聚合速度/〔nt/min〕 1010～1200 3. 大肠杆菌起点与复制起始有关的酶与协助因子 参加复制的蛋白质和酶 Dna A Dna B Dna C HU 引物合成酶〔Dna G〕 单链DNA结合蛋白〔SSB〕 RNA聚合酶 DNA旋转酶〔拓扑异构酶Ⅱ〕 Dam甲基化酶 识别起点序列，在起点特异位置解开双链 解开DNA双链 协助Dna B结合于起点 类组蛋白，DNA结合蛋白，促进起始 合成RNA引物 结合单链DNA 促进Dna A活性 释放DNA解链过程产生的扭曲张力 使起点GATC序列的腺嘌呤甲基化 七、基因重组 1. 基因重组的分类：同源重组、位点特异性重组、转座重组和异样重组。

2. 同源重组的分子模型——Holliday模型〔1〕步骤：a. 两个同源染色体的DNA排列整齐；b. 两个DNA分子的同一部位两个单链发生断裂引发重组；c. 断裂的单链游离末端彼此交换，每一条链与另一DNA对应的链连接，形成的连接分子成为Holliday中间体；d. 通过分支迁移产生异源双链DNA〔2〕双链断裂模型：但是更多地事实证明，重组是由双链断裂断裂启动的同源DNA分子之一发生双链断裂，经过核酸和解旋酶作用，产生具有3‘端的单链它在另一DNA分子的同源区找寻互补链并与之配对相对应的链那么被置换出来，与原来断裂的链配对，经过修复合成和链的再连接，形成两个穿插而不是单链穿插形成一个穿插此时此刻一般认为，同源重组是减数分裂的缘由，而不是减数分裂地结果DNA双链断裂才能够与同源分子发生链的交换，将同源染色体安排到子代细胞中去 因此，双链断裂启动重组，也启动了减数分裂 八、DNA的转座1. 概念：DN。