天然产物的提取分离与结构鉴定.ppt

第二章第二章   天然产物的提取天然产物的提取分离和结构鉴定分离和结构鉴定  •一、基本概念一、基本概念•1、、提提取取：：利利用用适适当当的的溶溶剂剂或或方方法法，，将将所所要成分尽可能从原料中完全提出的过程要成分尽可能从原料中完全提出的过程•2、、分分离离：：将将提提取取物物中中所所含含的的各各种种成成分分一一一一分分开开，，并并将将得得到到的的单单体体加加以以精精制制的的过过程   第一节第一节   天然产物的提取天然产物的提取 研究天然产物化学成分的基本步骤原材料原材料单体化合物单体化合物总提取物总提取物不同部位不同部位目的化合物目的化合物结构修饰结构修饰人工合成人工合成提取提取初步分离初步分离精细分离纯化精细分离纯化    水水      亲水性有机溶剂亲水性有机溶剂    亲脂性有机溶剂亲脂性有机溶剂二、提取方法二、提取方法l超临界流体萃取法（超临界流体萃取法（SFE））l水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法l溶剂提取法溶剂提取法l升华法升华法l压榨法压榨法溶剂溶剂（一）（一）溶剂提取法溶剂提取法 溶溶剂剂提取法原理提取法原理——“相似相溶相似相溶” 溶溶剂剂的选择的选择取决于被提取成分化学取决于被提取成分化学结结构、构、 溶解性及溶溶解性及溶剂剂的性的性质质。

注意：注意： 乙醇、甲醇乙醇、甲醇虽虽然属于然属于亲亲水性溶水性溶剂剂，可与水混溶，，可与水混溶，但很多但很多亲亲脂性成分可溶于乙醇、甲醇，所以乙醇或甲脂性成分可溶于乙醇、甲醇，所以乙醇或甲醇提取液中既有水溶性成分，也有很多脂溶性成分醇提取液中既有水溶性成分，也有很多脂溶性成分 •溶剂提取法溶剂提取法•        根根据据天天然然成成分分的的溶溶解解性性不不同同，，选选用用对对所所需需成成分分溶溶解解度度大大而而对对其其他他成成分分溶溶解解度度小小的的溶溶剂剂，，将将所所需需成成分分从从生生物物材材料料中中溶溶解解出出来的一种提取方法来的一种提取方法                     溶剂提取是指溶剂进入生物体细胞，溶剂提取是指溶剂进入生物体细胞，溶解或分散其有用物质而变成浸出物的全溶解或分散其有用物质而变成浸出物的全过程           包括浸润、解吸和扩散三个阶段包括浸润、解吸和扩散三个阶段1、溶剂提取法的原理、溶剂提取法的原理选择溶剂依据相似相溶原理选择溶剂依据相似相溶原理    浸润：渗透阶段浸润：渗透阶段 溶剂通过细胞壁渗透到细胞中。

溶剂通过细胞壁渗透到细胞中解吸：溶解阶段解吸：溶解阶段 细胞内容物与细胞组织之间有亲和细胞内容物与细胞组织之间有亲和 力，溶剂破除这种亲和力力，溶剂破除这种亲和力扩散：置换阶段扩散：置换阶段 利用细胞内的渗透力产生的压差而抽利用细胞内的渗透力产生的压差而抽提出来，用溶剂占领内容物的位置而提出来，用溶剂占领内容物的位置而 将内容物置换出来将内容物置换出来•2、选择溶剂的要点、选择溶剂的要点     * 对所要成分溶解度大对所要成分溶解度大     * 沸点适中容易回收沸点适中容易回收     * 低毒安全低毒安全     * 廉价廉价           天然产物成分中，萜、甾等大环、稠环化天然产物成分中，萜、甾等大环、稠环化合物极性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等合物极性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等极性溶剂中；酸碱性成分因易溶于水、乙醇等极性溶剂中；酸碱性成分因存在状态不同溶解性不同存在状态不同溶解性不同           最常用的溶剂为乙醇最常用的溶剂为乙醇3、常用溶剂的分类、常用溶剂的分类      水及酸水或碱水等水及酸水或碱水等，，适合提取无机盐、可适合提取无机盐、可溶性糖、多酚类、氨基酸、水溶性蛋白质、有溶性糖、多酚类、氨基酸、水溶性蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类等。

机酸盐、生物碱盐、苷类等1.强极性溶剂强极性溶剂2. 弱极性溶剂弱极性溶剂3. 非极性溶剂非极性溶剂      亲脂性有机溶剂亲脂性有机溶剂，，如乙醚、氯仿、乙酸乙酯、苯、如乙醚、氯仿、乙酸乙酯、苯、石油醚、环己烷等石油醚、环己烷等适合提取：除蛋白质、粘液质、适合提取：除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉与部分多糖外，大多可溶；部分脂溶成果胶、淀粉与部分多糖外，大多可溶；部分脂溶成分亦可溶通过调节乙醇浓度、加酸、加碱可改变分亦可溶通过调节乙醇浓度、加酸、加碱可改变分离效果分离效果      亲水性有机溶剂亲水性有机溶剂，，如甲醇、乙醇、丙酮如甲醇、乙醇、丙酮适合提取极性小的成分，但渗透性差，易燃、易适合提取极性小的成分，但渗透性差，易燃、易挥发，常有毒性；样品中水分多则提取效果差挥发，常有毒性；样品中水分多则提取效果差水水> >甲醇甲醇>乙醇乙醇>丙酮丙酮>乙酸乙酯乙酸乙酯>乙醚乙醚>氯仿氯仿>苯苯>石油醚石油醚  常见溶剂极性的强弱顺序常见溶剂极性的强弱顺序 ：：• 4、溶剂的选择、溶剂的选择 •(1) (1) 水水：：为为价价廉廉、、易易得得、、使使用用安安全全的的强强极极性性溶溶剂剂。

适适于于提提取取无无机机盐盐、、糖糖、、氨氨基基酸酸、、蛋蛋白白质质、、有机酸盐、生物碱盐、苷类等有机酸盐、生物碱盐、苷类等•(2) (2) 亲亲水水性性有有机机溶溶剂剂：：以以乙乙醇醇最最常常用用高高浓浓度度提取亲脂性成分，低浓度提取亲水性成分提取亲脂性成分，低浓度提取亲水性成分•(3)(3)   亲脂性有机溶剂：亲脂性有机溶剂：• 具具有有较较强强的的选选择择性性，，对对挥挥发发油油、、油油脂脂、、叶叶绿绿素素、、树树脂脂、、内内酯酯、、某某些些生生物物碱碱及及一一些些苷苷元元均均可提取出来可提取出来 优优缺缺点点：：沸沸点点低低，，浓浓缩缩回回收收方方便便，，但但易易燃燃、、有毒、价贵，穿透力差有毒、价贵，穿透力差5、溶剂提取的方法、溶剂提取的方法                                                                        溶剂提取的方法溶剂提取的方法连续回流提取法连续回流提取法回流提取法回流提取法煎煮法（煎中药）煎煮法（煎中药）渗漉法渗漉法浸渍法（泡药酒）浸渍法（泡药酒）（（1）浸渍）浸渍特点特点      适用于较易提取的适用于较易提取的有效成分遇热易破坏以有效成分遇热易破坏以及含多量淀粉、树胶及含多量淀粉、树胶、、果胶、粘液质的天然物果胶、粘液质的天然物的提取。

的提取适用范围适用范围特点：浸出率较差，特特点：浸出率较差，特别是用水为溶剂，其提别是用水为溶剂，其提取液易于发霉变质，须取液易于发霉变质，须注意加入适当的防腐剂注意加入适当的防腐剂粉碎好的药材放入提取用的容中，加粉碎好的药材放入提取用的容中，加入溶剂使没过药面，浸泡入溶剂使没过药面，浸泡1212小时滤出溶剂，加入新的溶剂继续提取滤出溶剂，加入新的溶剂继续提取加入溶剂浸泡加入溶剂浸泡12小时后小时后浸浸渍渍法法（（2 2））渗漉法渗漉法向原料粗粉中不断添向原料粗粉中不断添加溶剂，使其渗过原加溶剂，使其渗过原料，从渗漉筒下端出料，从渗漉筒下端出口流出浸出液的一种口流出浸出液的一种浸出方法浸出方法（（2）渗漉）渗漉特点特点      当溶剂渗进原料当溶剂渗进原料溶出成分比重加大而溶出成分比重加大而向下移动时，上层的向下移动时，上层的溶液或稀浸出液便置溶液或稀浸出液便置换其位置，造成良好换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能的浓度差，使扩散能较好地进行较好地进行原理原理特点：浸出效率较高，特点：浸出效率较高，浸出液较澄清浸出液较澄清 溶剂消耗量大、费溶剂消耗量大、费时长。

时长                            （（3）煎煮法）煎煮法 以水为溶剂，对遇热易破坏和挥发性以水为溶剂，对遇热易破坏和挥发性成分有影响，对含多量淀粉、黏液质的原成分有影响，对含多量淀粉、黏液质的原料也不适用料也不适用 传统的中药煎制传统的中药煎制    （（4）回流提取法）回流提取法使用有机溶剂对遇热易破坏的成分有影响使用有机溶剂对遇热易破坏的成分有影响   （（5）连续回流提取法）连续回流提取法索式提取器的组成索式提取器的组成 循环使用挥发性的有机溶剂，在脂肪提取器中连循环使用挥发性的有机溶剂，在脂肪提取器中连续提取的方法续提取的方法 提取效率高，节省溶剂但不适于热不稳定成分提取效率高，节省溶剂但不适于热不稳定成分的提取 也可采用混合溶剂，常用的有水和乙醇不同也可采用混合溶剂，常用的有水和乙醇不同比例的溶剂可提出不同成分，如比例的溶剂可提出不同成分，如CHClCHCl3 3-C-C2 2H H5 5OH(95OH(95: :5)5)可提取出强心甙、有机酸、叶绿素等。

可提取出强心甙、有机酸、叶绿素等   连续回流连续回流   (索氏提取索氏提取)    ①.把滤纸做成与提取器大小相应的滤纸筒，然后把需要提取的样品放入滤纸筒内，装入提取器注意注意: :a.a.滤纸筒既要紧贴器壁，又要方便取放滤纸筒上可以滤纸筒既要紧贴器壁，又要方便取放滤纸筒上可以套一圈棉线，方便提取完成后取出滤纸筒套一圈棉线，方便提取完成后取出滤纸筒b.b.被提取物高度不能超过虹吸管，否则被提取物不能被溶被提取物高度不能超过虹吸管，否则被提取物不能被溶剂充分浸泡，影响提取效果被提取物亦不能漏出滤纸筒，剂充分浸泡，影响提取效果被提取物亦不能漏出滤纸筒，以免堵塞虹吸管如果试样较轻，可以用脱脂棉压住试样以免堵塞虹吸管如果试样较轻，可以用脱脂棉压住试样 操作步骤：     ②.在提取用的烧瓶中加入提取溶剂和沸石（没有沸石可以用玻璃珠或碎瓷片，目的就是防止暴沸） ③.连接好烧瓶、提取器、回流冷凝管，接通冷凝水,加热沸腾后，溶剂的蒸气从烧瓶进到冷凝管中，冷凝后的溶剂回流到滤纸筒中，浸取样品溶剂在提取器内到达一定的高度时，就携带所提取的物质一同从侧面的虹吸管流入烧瓶中溶剂就这样在仪器内循环流动，把所要提取的物质集中到下面的烧瓶内。

     具体的回流时间是不一样的，有的具体的回流时间是不一样的，有的是按文献要求提取一定时间，有的是提是按文献要求提取一定时间，有的是提取至提取液无色，又比如用乙醚提取样取至提取液无色，又比如用乙醚提取样品中的脂肪时是以抽提管中流出的乙醚品中的脂肪时是以抽提管中流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点总之就挥发后不留下油迹为抽提终点总之就是要提取完全为止是要提取完全为止 旋转蒸发旋转蒸发旋转蒸发旋转蒸发薄膜蒸发薄膜蒸发    6、影响溶剂提取法的因素、影响溶剂提取法的因素（（1 1））生物材料的粉碎度生物材料的粉碎度 材料细，面积大，扩散快，效果好材料细，面积大，扩散快，效果好但是太细，吸附作用大，易糊化，扩散慢，但是太细，吸附作用大，易糊化，扩散慢，同时植物细胞也会遭受破坏，大量蛋白质、同时植物细胞也会遭受破坏，大量蛋白质、淀粉被提出，产生沉淀或胶束状，影响提淀粉被提出，产生沉淀或胶束状，影响提取 花、叶可适当粗些，皮、茎、根宜细花、叶可适当粗些，皮、茎、根宜细些    （（2）提取温度）提取温度 一般使用常温，在不破坏有效成分的条一般使用常温，在不破坏有效成分的条件下加热不要超过件下加热不要超过80˚C。

温度低提取时的杂质少，温度高时提取温度低提取时的杂质少，温度高时提取效率高；但含淀粉、粘液质较多的材料，水效率高；但含淀粉、粘液质较多的材料，水提时避免热提提时避免热提    （（3）提取时间）提取时间 以提完为准，是否完全可以提取也做定性以提完为准，是否完全可以提取也做定性实验，或薄层层析检测，或以液体颜色判断实验，或薄层层析检测，或以液体颜色判断 根据检测结果确定是否需要延长提取时间根据检测结果确定是否需要延长提取时间    （（4）浓度差）浓度差 根据扩散原理，造成提取液的浓度差可根据扩散原理，造成提取液的浓度差可以提高提取的效率以提高提取的效率 可采取的措施有：搅拌、更换溶剂可采取的措施有：搅拌、更换溶剂    （（5）新技术的使用）新技术的使用 超声波、微波促提技术的应用，可以加快提超声波、微波促提技术的应用，可以加快提取速度，提高提取效率取速度，提高提取效率 目前实验室广泛使用的超声波萃取仪是将超目前实验室广泛使用的超声波萃取仪是将超声波换能器产生的超声波通过介质（通常是水）声波换能器产生的超声波通过介质（通常是水）传递并作用于样品，这是一种间接的作用方式，传递并作用于样品，这是一种间接的作用方式，声振强度较低，必须通过增加超声波发生器功率声振强度较低，必须通过增加超声波发生器功率（（3300W）来提高萃取效率。

但较大的超声波功）来提高萃取效率但较大的超声波功率，又会发出令人感觉不适的噪音率，又会发出令人感觉不适的噪音超声波促提原理：超声波促提原理：             为物理过程，无化学反应，不改变生物活为物理过程，无化学反应，不改变生物活性，高能量的超声波产生的强大压力，可造成性，高能量的超声波产生的强大压力，可造成植物细胞壁及生物体破裂，导致胞内物质释放、植物细胞壁及生物体破裂，导致胞内物质释放、扩散、溶解扩散、溶解 实验室用小型超声仪实验室用小型超声仪 工业生产用超声仪工业生产用超声仪      微波辅助技术是利用样品中目标物分子在微波辅助技术是利用样品中目标物分子在微波电磁场的作用下，从原来的热运动状态转微波电磁场的作用下，从原来的热运动状态转为跟随微波交变电磁场而快速排列取向，将微为跟随微波交变电磁场而快速排列取向，将微波能量转化为样品内的能量，从而加速目标物波能量转化为样品内的能量，从而加速目标物从固相进入溶剂相的过程从固相进入溶剂相的过程 微波促提原理：微波促提原理：• 微波加热机制： 极性分子作用机制: 极性分子存在一定的偶极矩，当它处于一定的静电场中时，偶极分子就有呈方向性的趋势，即带正电的一端朝向负极，带负电的一端朝向正极。

当电磁场方向变化时，偶极子的取向也随之改变，分子发生摆动 当微波的频率较高时，如 2450MHz2450MHz2450MHz2450MHz ，即1秒钟内电场变化 2.45×109 次，极性分子也随之发生 2.45×109次的摆动由于分子的热运动和相邻分子间的相互作用，阻碍和干扰分子随电场的摆动，产生类似摩擦的作用，使分子获得能量并以热的形式表现出来加热机制            微波具有穿透力强，加热效率高，操作简微波具有穿透力强，加热效率高，操作简便、快速、节能、高效等特点便、快速、节能、高效等特点 缺点：化学成分的结构易发生变化，继缺点：化学成分的结构易发生变化，继而导致生物活性的改变而导致生物活性的改变        微波提取尤其要注意能量的控制，被提取微波提取尤其要注意能量的控制，被提取物质的稳定性物质的稳定性 工业生产用微波提取罐工业生产用微波提取罐   （二）水蒸气蒸馏法（二）水蒸气蒸馏法 适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的有效成分结构的提取如挥发油、小分破坏的有效成分结构的提取。

如挥发油、小分子生物碱、酚类、游离醌类等子生物碱、酚类、游离醌类等        水蒸气蒸馏法是将水蒸气通入不溶或难溶水蒸气蒸馏法是将水蒸气通入不溶或难溶于水但有一定挥发性的有机物质中，使该有机于水但有一定挥发性的有机物质中，使该有机物在低于物在低于100℃100℃的温度下，随着水蒸气一起蒸的温度下，随着水蒸气一起蒸馏出来原理：道尔顿分压定律原理：道尔顿分压定律     水蒸气蒸馏装置水蒸气蒸馏装置 常用的水蒸气蒸馏装置，包括水蒸气发生器、常用的水蒸气蒸馏装置，包括水蒸气发生器、蒸馏、冷凝和接受器四个部分蒸馏、冷凝和接受器四个部分 （三）升华法（三）升华法装置图装置图适用范围适用范围某些固体物质（如水杨酸、某些固体物质（如水杨酸、苯甲酸、樟脑等）受热后，苯甲酸、樟脑等）受热后，在低于其熔点的温度下，在低于其熔点的温度下，不经过熔化就可以直接转不经过熔化就可以直接转化为蒸汽，蒸汽遇冷又凝化为蒸汽，蒸汽遇冷又凝结为固体称为升华结为固体称为升华    1、将茶叶与、将茶叶与95%乙醇回流乙醇回流2h；；2、滤出茶叶，浓缩提取液至适当体积；、滤出茶叶，浓缩提取液至适当体积；3、浓缩液与生石灰粉混合，搅成浆状，用蒸发皿、浓缩液与生石灰粉混合，搅成浆状，用蒸发皿在蒸汽浴上蒸干，除去水份；在蒸汽浴上蒸干，除去水份；4、在蒸发皿上盖一张刺孔向上的滤纸，再在滤纸、在蒸发皿上盖一张刺孔向上的滤纸，再在滤纸上罩一个大小适合且颈部塞有棉花的漏斗；上罩一个大小适合且颈部塞有棉花的漏斗；5、用酒精灯隔石棉网加热，适当控制温度，白色、用酒精灯隔石棉网加热，适当控制温度，白色咖啡因在滤纸上结晶。

咖啡因在滤纸上结晶实验室提取咖啡因步骤：实验室提取咖啡因步骤：升升   华华（四）（四）超临界流体萃取超临界流体萃取       在临界区附近，压力和温度的微小变化，会引起在临界区附近，压力和温度的微小变化，会引起流体密度的大幅度变化，从而影响其溶解能力流体密度的大幅度变化，从而影响其溶解能力       物质在不同温度和压力的条件下，可以物质在不同温度和压力的条件下，可以以以不同不同的形态存在，如固体，液体，气体，超临界流体等的形态存在，如固体，液体，气体，超临界流体等在超临界流体中，不同的物质有不同的溶解度，溶在超临界流体中，不同的物质有不同的溶解度，溶解度大的物质溶解在超临界流体中，与不溶解或者解度大的物质溶解在超临界流体中，与不溶解或者溶解度小的物质分开然后，通过升高温度，降低溶解度小的物质分开然后，通过升高温度，降低压力或者吸附的方法，使萃取物与超临界流体分离，压力或者吸附的方法，使萃取物与超临界流体分离，而得到所需的物质而得到所需的物质原理原理超临界状态超临界状态P-T相图相图气态气态 = 液态液态临界点临界点:气、液界气、液界面刚刚消失的状面刚刚消失的状态点态点(Pc、、Tc)为什么超临界流体是良好的萃取剂为什么超临界流体是良好的萃取剂液体液体超临界流体超临界流体气体气体超临界流体的物理性质和传质特性介于液体和气体之间超临界流体的物理性质和传质特性介于液体和气体之间超临界流体的溶解能力与液体的溶解能力接近；扩散系数接超临界流体的溶解能力与液体的溶解能力接近；扩散系数接近于气体近于气体 液体液体气体气体超临界流体超临界流体溶解能力溶解能力扩扩散散系系数数优良性能的萃取剂优良性能的萃取剂溶剂萃取溶剂萃取超临界萃取超临界萃取溶剂残留不可避免溶剂残留不可避免完全无溶剂残留，纯净完全无溶剂残留，纯净存在重金属存在重金属无重金属无重金属溶剂的溶解能力为定值溶剂的溶解能力为定值溶解能力随温度和压力变化溶解能力随温度和压力变化可能使用高温，热敏物质分解可能使用高温，热敏物质分解通常在较低温度下，不分解通常在较低温度下，不分解存在无机盐被萃取的问题存在无机盐被萃取的问题无无机盐残留无无机盐残留溶剂选择性差溶剂选择性差选择性好选择性好需额外的操作单元来脱除溶解需额外的操作单元来脱除溶解分离，有效物质收率高分离，有效物质收率高溶剂萃取和超临界萃取的对比溶剂萃取和超临界萃取的对比           最常用的是二氧化碳超临界萃取法，环保、成最常用的是二氧化碳超临界萃取法，环保、成本低、提取分离一步完成。

分子的极性、沸点和分本低、提取分离一步完成分子的极性、沸点和分子量的大小与其在二氧化碳超临界流体中的溶解性子量的大小与其在二氧化碳超临界流体中的溶解性密切相关密切相关三）超临界流体萃取法（三）超临界流体萃取法 超临界二氧化碳超临界二氧化碳流体流体(SFE-CO2)临界点临界点(31.1℃)相当接近室温相当接近室温超临界二氧化碳萃取超临界二氧化碳萃取 二氧化碳二氧化碳在温度高于临界温度在温度高于临界温度TcTc=31.26℃=31.26℃，压力，压力高于临界压力高于临界压力Pc=7.4MPaPc=7.4MPa的状态下，性质会发生变化，的状态下，性质会发生变化，其密度近于液体，粘度近于气体，扩散系数为液体的其密度近于液体，粘度近于气体，扩散系数为液体的100100倍，倍，因而具有因而具有惊人的溶解能力惊人的溶解能力用它可溶解多种用它可溶解多种物质，然后提取其中的有效成分，具有广泛的应用前物质，然后提取其中的有效成分，具有广泛的应用前景超临界二氧化碳是目前研究最广泛的流体之一，景超临界二氧化碳是目前研究最广泛的流体之一，因为它具有以下几个特点：因为它具有以下几个特点： (1)CO(1)CO2 2临界温度为临界温度为31.26℃31.26℃，临界压力为，临界压力为7.4MPa7.4MPa，临，临 界条件容易达到界条件容易达到. . (2)CO(2)CO2 2化学性质不活泼，无色无味无毒，安全性好化学性质不活泼，无色无味无毒，安全性好. .(3)(3)价格便宜，纯度高，容易获得价格便宜，纯度高，容易获得. .        利用超临界条件下流体的特殊性能对样品利用超临界条件下流体的特殊性能对样品进行提取，是进行提取，是20世纪世纪80年代迅速发展起来的一年代迅速发展起来的一种提取方法。

种提取方法 超临界流体不但具有与液体接近的密度，超临界流体不但具有与液体接近的密度，有很强的穿透性，接近或超过溶剂的提取效率；有很强的穿透性，接近或超过溶剂的提取效率；而且具有与气体相近的扩散的性能，提取效率而且具有与气体相近的扩散的性能，提取效率越高 常用的超临界流体有常用的超临界流体有CO2、乙烷、丙烷等乙烷、丙烷等     与普通有机溶剂提取法相比，超临界与普通有机溶剂提取法相比，超临界CO2萃取技术具有无毒、常温、不易燃、萃取技术具有无毒、常温、不易燃、无污染等特点，可确保原有的色、香、味无污染等特点，可确保原有的色、香、味不因受热破坏；更为可贵的是在萃取过程不因受热破坏；更为可贵的是在萃取过程中可同时对萃取物进行分离纯化该技术中可同时对萃取物进行分离纯化该技术适宜于萃取高价值的油脂（包括天然功能适宜于萃取高价值的油脂（包括天然功能性油脂）、精油、内酯等极性较低的天然性油脂）、精油、内酯等极性较低的天然产物有效成分产物有效成分 　　超临界超临界CO2提取的特点提取的特点    CO2 钢瓶钢瓶 冷温槽冷温槽 高压泵高压泵恒恒温温箱箱控温面板控温面板 接受瓶接受瓶 流量计流量计 CO2 原料原料 玻璃珠玻璃珠 脱脂棉脱脂棉 萃取柱萃取柱 超临界超临界CO2 萃取实验装置示意图萃取实验装置示意图    液体液体CO2由高压泵加压到萃取工艺要求的由高压泵加压到萃取工艺要求的压力并传送到换热器，将压力并传送到换热器，将CO2流体加温到萃取流体加温到萃取工艺所需温度后进入萃取器，在此完成萃取过工艺所需温度后进入萃取器，在此完成萃取过程。

负载溶质的程负载溶质的CO2流体在分离器中改变温度流体在分离器中改变温度压力，溶解度降低使萃取物得以分离分离萃压力，溶解度降低使萃取物得以分离分离萃取物后的取物后的CO2流体再经换热器液化后回到储罐流体再经换热器液化后回到储罐中循环使用中循环使用超临界超临界CO2提取操作流程提取操作流程     20世纪世纪50年代初进入试验阶段，如从石油中年代初进入试验阶段，如从石油中脱沥青 70、、80年代年代SFE用于食品香料的提取用于食品香料的提取 90年代从植物药中提取目标成分，如从蛇床子、年代从植物药中提取目标成分，如从蛇床子、桑白皮、茵陈蒿中提取活性成分桑白皮、茵陈蒿中提取活性成分 大型超临界流体萃取装置大型超临界流体萃取装置超临界流体萃取技术的应用超临界流体萃取技术的应用超临界流体萃取技术的应用超临界流体萃取技术的应用第二节第二节第二节第二节   天然产物的分离天然产物的分离天然产物的分离天然产物的分离一、经典分离方法一、经典分离方法1.溶剂法溶剂法6.分馏法分馏法5.升华法升华法4.膜分离法膜分离法3.沉淀法沉淀法2.结晶法结晶法1.溶剂法包括溶剂法包括（（1））系统溶剂分离法系统溶剂分离法（（2））两项溶剂萃取法两项溶剂萃取法（（1）系统溶剂法）系统溶剂法原理原理       依据依据“相似相溶相似相溶”的原理，按极性由小到大的顺序的原理，按极性由小到大的顺序依次提取分离总提液中各种溶解度有差异的成分依次提取分离总提液中各种溶解度有差异的成分。

  石油醚、己烷石油醚、己烷→挥发油、脂溶性色素、蜡挥发油、脂溶性色素、蜡  乙醚、氯仿乙醚、氯仿→生物碱、苷元生物碱、苷元  乙酸乙酯乙酸乙酯→黄酮苷黄酮苷  正丁醇正丁醇→皂苷、蒽醌苷皂苷、蒽醌苷  甲醇、乙醇甲醇、乙醇→苷、糖类、生物碱盐苷、糖类、生物碱盐适用范围适用范围优缺点优缺点       此法是早此法是早 年研究天然药年研究天然药物有效成分的一种最重要的物有效成分的一种最重要的方法，主要用于分离提纯含方法，主要用于分离提纯含有极性不同的各种化学成分有极性不同的各种化学成分的中药提取液目前仍是最的中药提取液目前仍是最常用的方法，常用的方法，       此法操作繁琐，对化学此法操作繁琐，对化学性质不稳定，容易引起分解、性质不稳定，容易引起分解、异构化的天然产物应特别注异构化的天然产物应特别注意在微量成分、结构性质微量成分、结构性质相似成分相似成分的分离纯化上受到的分离纯化上受到很大限制很大限制（（2）两项溶剂萃取法）两项溶剂萃取法原理原理      利用混合物中各单体组分利用混合物中各单体组分在两相溶剂中的分配系数在两相溶剂中的分配系数（（K）不同而达到分离的方法不同而达到分离的方法。

       溶剂分配法的两相往往是溶剂分配法的两相往往是互相饱和的水相与有机相混互相饱和的水相与有机相混合物中各成分在两相中分配系合物中各成分在两相中分配系数相差越大，则分离效果越高数相差越大，则分离效果越高萃取的方法萃取的方法1）简单萃取法：）简单萃取法：实验室用实验室用分液漏斗分液漏斗，，一般在水和亲脂一般在水和亲脂性有机溶剂中进行，根据情性有机溶剂中进行，根据情况，可用酸水或碱水况，可用酸水或碱水中药中药中成分比较复杂中成分比较复杂，，2））pH度萃取法：度萃取法：以以pH成梯度成梯度的酸的酸（碱）（碱）水溶液依次萃取以水溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的碱亲脂性有机溶剂溶解的碱（酸）（酸）性成梯度的混合生物碱性成梯度的混合生物碱(混合混合酚酚、、 酸类酸类)，， 使后者分离的方法使后者分离的方法萃取分离不出来纯品萃取分离不出来纯品一次一次3）连续萃取法：）连续萃取法：采采用连续萃取器萃取用连续萃取器萃取利用两溶液比重不同自然分利用两溶液比重不同自然分     层和分散相液滴穿过连续相层和分散相液滴穿过连续相 溶剂时发生传质此法可克溶剂时发生传质此法可克 服分液漏斗多次萃取的麻烦。

服分液漏斗多次萃取的麻烦4）液滴逆流分配法）液滴逆流分配法（（DCCC法）：法）：是利用流动相形成液滴，通是利用流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的分离纯化的目的双水相萃取法双水相萃取法（一）、概述（一）、概述（一）、概述（一）、概述 早在早在18961896年年, ,学者发现学者发现, ,当明胶与琼脂或明胶与可溶当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时性淀粉溶液相混时, ,得到一个混浊不透明的溶液，随之得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相分为两相, ,上相富含明胶上相富含明胶, ,下相富含琼脂下相富含琼脂( (或淀粉或淀粉), ), 这种现这种现象被称为聚合物的不相溶性，从而产生了双水相体系象被称为聚合物的不相溶性，从而产生了双水相体系 双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。

分为二相 •利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，瑞典的Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法 •20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化开辟了新的途径双水相萃取法概述概述（二）双水相系统及特点（二）双水相系统及特点1 1、什么是双水相系统？、什么是双水相系统？聚合物的不相容（溶）性： 把两种或两种以上具有一定浓度的亲水性聚合物溶液混合后把两种或两种以上具有一定浓度的亲水性聚合物溶液混合后静置，这些亲水性的高分子聚合物并不混为一相，而是分成两个静置，这些亲水性的高分子聚合物并不混为一相，而是分成两个液相，这种含有聚合物分子的溶液发生液相，这种含有聚合物分子的溶液发生分相分相的现象称为聚合物的的现象称为聚合物的不相溶性不相溶性聚乙二醇聚乙二醇(PEG)溶液溶液葡聚糖葡聚糖( (DxDx) )溶液溶液利用双水相的成相现象及待分离组分在两相间分配系数差异，进行组分分离或多水相提纯技术双水相体系：双水相体系：分相的聚合物都是以水作为溶剂，称双水相体系分相的聚合物都是以水作为溶剂，称双水相体系双水相萃取技术：双水相萃取技术：聚合物不相容性的原因：聚合物不相容性的原因：聚合物分子的空间阻碍作用，相互之间无法渗透而分离成多相聚合物分子的空间阻碍作用，相互之间无法渗透而分离成多相 聚乙二醇聚乙二醇( (PEG)/PEG)/葡聚糖葡聚糖( (DxDx) )；； 聚丙二醇聚丙二醇/ /聚乙二醇；聚乙二醇； 甲基纤维素甲基纤维素( (methylcellulose)/methylcellulose)/葡聚糖。

葡聚糖 双水相萃取中常采用的双聚合物系统为双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/PEG/DxDx，，该双水相的该双水相的上相富含上相富含PEGPEG，，下相富含下相富含DxDx除双聚合物系统外，聚合物与无机除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/PEG/磷酸钾磷酸钾、、PEG/PEG/磷酸铵、磷酸铵、PEG/PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取PEG/PEG/无机盐系统的无机盐系统的上相富含上相富含PEGPEG，，下相富含无机盐下相富含无机盐 常见双水相系统？常见双水相系统？2 2、双水相萃取法的特点、双水相萃取法的特点◆◆能够保留产物的活性能够保留产物的活性◆◆整个操作可以连续化整个操作可以连续化◆◆与传统的沉淀法相比，要优越得多与传统的沉淀法相比，要优越得多◆◆已被广泛地应用在蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化已被广泛地应用在蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化ββ- -半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。

　　   影响待分离物质在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等萃取原理萃取原理双水相萃取技术的应用双水相萃取技术的应用　   双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域，并取得了许生物学、生物化工和食品化工等领域，并取得了许多成功的范例，主要是分离蛋白质多成功的范例，主要是分离蛋白质 ，酶，病毒，脊，酶，病毒，脊髓病毒和线病毒的纯化，核酸，髓病毒和线病毒的纯化，核酸，DNADNA的分离，干扰的分离，干扰素，细胞组织，抗生素，多糖，色素，抗体等素，细胞组织，抗生素，多糖，色素，抗体等         此外双水相还可用于稀有金属／贵金属分离，此外双水相还可用于稀有金属／贵金属分离，传统的稀有金属／贵金属溶剂萃取方法存在着溶剂传统的稀有金属／贵金属溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境，对人体有害，运行成本高，工艺复杂等污染环境，对人体有害，运行成本高，工艺复杂等缺点双水相技术萃取技术引入到该领域，无疑是缺点双水相技术萃取技术引入到该领域，无疑是金属分离的一种新技术。

金属分离的一种新技术•双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取; PEG的循环; 无机盐的循环双水相萃取的工艺流程双水相萃取的工艺流程•分离和提纯各种蛋白质分离和提纯各种蛋白质( (酶）酶）        用用聚乙二醇聚乙二醇( (PEGPEG) )/ -(NH/ -(NH4 4) ) 2 2SOSO4 4 双水相体系双水相体系, ,经一次萃取经一次萃取从从 α- α- 淀粉酶发酵液中分离提取淀粉酶发酵液中分离提取 α - α - 淀粉酶和蛋白酶；萃取淀粉酶和蛋白酶；萃取最适宜条件为最适宜条件为PEG1000 ( 15 %) PEG1000 ( 15 %) ––(NH(NH4 4) ) 2 2SOSO4 4 (20 %) , pH = (20 %) , pH = 8 8 ，，α- α- 淀粉酶收率为淀粉酶收率为90 % 90 % ，分配系数为，分配系数为19. 619. 6，蛋白酶的分，蛋白酶的分离系数高达离系数高达15. 115. 1比活率为原发酵液的比活率为原发酵液的1. 5 1. 5 倍，蛋白酶在倍，蛋白酶在水相中的收率高于水相中的收率高于60 %60 %。

双水相的应用举例•提取抗生素和分离生物粒子提取抗生素和分离生物粒子• 采用PEG/ Na2HPO4 体系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取条件是pH= 8. 0～8. 5 ， PEG2000 (14 %) / Na2HPO4 (18 %) ,小试收率达69. 2 % ,对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53. 4 %双水相的应用举例•目前存在的问题：       虽然该技术在应用方面已经取得了很大的进展，但几乎都是建立在实验的基础上，到目前为止还没能完全清楚地从理论上解释双水相系统的形成机理以及生物分子在系统中的分配机理存在的问题存在的问题1 1、定义、定义 反胶束或称逆胶束反胶束或称逆胶束(Reversed micelle) (Reversed micelle) 是指当有机溶剂中是指当有机溶剂中加入表面活性剂并令其浓度超过某临界值时，表面活性剂便会加入表面活性剂并令其浓度超过某临界值时，表面活性剂便会自发地在有机溶剂中形成一种稳定的大小为纳米级的聚集体自发地在有机溶剂中形成一种稳定的大小为纳米级的聚集体 在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。

此极性机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了““水池水池”” 反胶团（胶束）萃取反胶团（胶束）萃取反胶团（胶束）萃取反胶团（胶束）萃取反胶团（胶束）萃取反胶团（胶束）萃取(静电引力：静电引力：主要是蛋白质的表面电荷与反胶束内主要是蛋白质的表面电荷与反胶束内表面电荷（离子型表面活性剂）之间的静电引力表面电荷（离子型表面活性剂）之间的静电引力作用 (空间位阻作用：空间位阻作用：增大反胶束极性核的尺寸，以减增大反胶束极性核的尺寸，以减小大分子蛋白进入胶核的传质阻力小大分子蛋白进入胶核的传质阻力凡是能够引起静电引力，能够促使反胶束尺寸增凡是能够引起静电引力，能够促使反胶束尺寸增大的因素均有利于提高分配系数大的因素均有利于提高分配系数这些因素主要是这些因素主要是pHpH、离子强度、表面活性剂种类、离子强度、表面活性剂种类和浓度等，通过因素优化，实现选择性地萃取和和浓度等，通过因素优化，实现选择性地萃取和反萃取2.  反胶束萃取的原理：反胶束萃取的原理：3.反胶束的溶解作用微水池溶解和分离作用微水池溶解和分离作用：    反胶团的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。

 因此，反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子Z在反胶束内部包含了水溶液，蛋白质等生物分子在反胶束内部包含了水溶液，蛋白质等生物分子萃取后进入反胶团内部的萃取后进入反胶团内部的““水池水池” ” 中，避免了与中，避免了与有机溶剂直接接触，反胶束内的微环境与生物膜有机溶剂直接接触，反胶束内的微环境与生物膜内相似，故能很好保持其生物活性，解决了蛋白内相似，故能很好保持其生物活性，解决了蛋白质在有机溶剂中容易变性失活和难溶于有机溶剂质在有机溶剂中容易变性失活和难溶于有机溶剂的问题，为蛋白质的提取和分离开辟了一条新的的问题，为蛋白质的提取和分离开辟了一条新的途径Z成本低，有机溶剂可反复使用；容易放大和实现成本低，有机溶剂可反复使用；容易放大和实现连续操作连续操作 Z反胶束萃取是一条具有工业发展前景的蛋白质分反胶束萃取是一条具有工业发展前景的蛋白质分离技术 反胶束法的优点反胶束法的优点•（1）溶液的pH      pH影响蛋白质的电荷数量和电荷性质•（2）溶液的离子强度         影响微胶团的静电状态. 凡是对蛋白质所含电荷有影响的因素，如pH，以及对反胶束的静电状态有影响的因素，均能改变蛋白质的增溶作用。

•（3）表面活性剂的浓度和种类•（4）其他（有机溶剂、助表面活性剂、温度）3、、 影响反胶团萃取的因素影响反胶团萃取的因素 4. 4.胶束萃取的操作胶束萃取的操作A 萃取的基本方法萃取的基本方法B     反萃取反萃取     . C 分级萃取分级萃取AOT = 二-(2-已基)琥珀酸酯磺酸钠•5、应用举例•  纯化和分离蛋白质　  如对于溶菌酶和肌红蛋白的混合溶液(两种蛋白质相对分子量相近,等电点分别为11. 1 和6. 8），用二烷基磷酸盐/ 异辛烷反胶束溶液萃取，并用缓冲液将混合液的pH 值调至9. 0 ，则溶菌酶完全进入有机相中,而肌红蛋白则留在水相.提取或分离物提取或分离物  溶液溶液 结晶结晶 2.结晶法结晶法粗结晶粗结晶溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤放置（冷藏）析晶，过滤放置（冷藏）析晶，过滤重复上述操作（重结晶）重复上述操作（重结晶）3.沉淀法沉淀法      酸性或碱性化合物通过加入某酸性或碱性化合物通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类等沉淀析出而实现分离如生物类等沉淀析出而实现分离。

如生物碱加入有机酸可生成不溶于水的有碱加入有机酸可生成不溶于水的有机酸盐沉淀，酸性化合物可加入钙机酸盐沉淀，酸性化合物可加入钙盐、铅盐、钡盐等生成不溶性的沉盐、铅盐、钡盐等生成不溶性的沉淀  水醇沉淀法水醇沉淀法铅盐沉淀法铅盐沉淀法1）水提取醇沉淀法，于）水提取醇沉淀法，于水提浓缩液中加入乙醇使水提浓缩液中加入乙醇使含醇量达含醇量达60%以上，可使以上，可使多糖、蛋白质沉淀多糖、蛋白质沉淀2）醇提取水沉淀法，于）醇提取水沉淀法，于醇提取浓缩液中加入醇提取浓缩液中加入10倍倍量以上水，可沉淀亲脂性量以上水，可沉淀亲脂性成分       利用中性醋酸铅或碱式利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐沉淀而分离的铅盐或络盐沉淀而分离的方法酸碱沉淀法酸碱沉淀法专属试剂沉淀法专属试剂沉淀法1）酸提取碱沉淀：用于）酸提取碱沉淀：用于生物碱的提取分离生物碱的提取分离2）碱提取酸沉淀：用于）碱提取酸沉淀：用于酚、酸类成分和内酯类成酚、酸类成分和内酯类成分的提取、分离分的提取、分离      某些试剂能选择性地沉某些试剂能选择性地沉淀某类成分，称为专属试淀某类成分，称为专属试剂沉淀法。

剂沉淀法    （四）透析法（四）透析法 利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，大利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，大分子则不能通过半透膜的性质进行分离的方法分子则不能通过半透膜的性质进行分离的方法 如分离纯化皂甙、蛋白质、如分离纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等大分子时，用此法多肽、多糖等大分子时，用此法可除无机盐、单、双糖等小分子可除无机盐、单、双糖等小分子杂质杂质 透析膜的膜孔有大有小，视透析膜的膜孔有大有小，视具体情况而选择，常用透析膜：具体情况而选择，常用透析膜：动物性膜、火棉胶膜、硫酸纸膜、动物性膜、火棉胶膜、硫酸纸膜、玻璃纸膜等玻璃纸膜等    借助机械外力的作用，将油脂油脂从榨料中挤压出来的过程在压榨过程中，主要发生的是物理变化，如物料变形、油脂分离、摩擦发热、水分蒸发等但由于温度、水分、微生物等的影响，同时也会产生某些生物化学方面的变化，如蛋白质变性、酶的钝化和破坏、某些物质的结合等压榨时，榨料粒子在压力作用下内外表面相互挤紧，致使其液体部分和凝胶部分分别产生两个不同过程，即油脂从榨料空隙中被挤压出来及榨料粒子变形形成坚硬的油饼。

（五）压榨法（五）压榨法石油醚石油醚(流动相流动相)碳酸钙碳酸钙( (固定相固定相) )色色谱谱带带最早的色谱实验最早的色谱实验二、色谱分离法二、色谱分离法原理：原理：原理：原理：利用混合物中各成利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸分在固定相和移动相中吸附、分配及其亲和力的差附、分配及其亲和力的差异而达到分离异而达到分离   色谱色谱色谱色谱定义：定义：定义：定义：是一种物理化学分离分析技是一种物理化学分离分析技术，它利用混合物中各组分在固定相和流术，它利用混合物中各组分在固定相和流动相间的分配系数的差异，让各组分在两动相间的分配系数的差异，让各组分在两相间进行多次分配产生明显迁移速差而得相间进行多次分配产生明显迁移速差而得以分离又称之为以分离又称之为色谱分离法、层析法色谱分离法、层析法按移动相分按移动相分气相色谱气相色谱液相色谱液相色谱按色谱原理分按色谱原理分吸附色谱吸附色谱分配色谱分配色谱离子交换色谱离子交换色谱凝胶色谱凝胶色谱按操作方法分按操作方法分柱色谱柱色谱纸色谱纸色谱薄层色谱薄层色谱色谱的分类色谱的分类薄层色谱法薄层色谱法——定义定义分类吸附薄层色谱吸附薄层色谱分配薄层色谱分配薄层色谱       在平面载板上均匀涂布适宜的固定在平面载板上均匀涂布适宜的固定相形成一薄层，将欲分离的试样于薄层相形成一薄层，将欲分离的试样于薄层板上点样，随着移动相溶剂的移动展开，板上点样，随着移动相溶剂的移动展开，混合物中各成分获得分离的方法。

混合物中各成分获得分离的方法 常用的吸附剂常用的吸附剂——硅胶硅胶应用最为广泛应用最为广泛!粒径：粒径：200-300目目种类：种类：硅胶硅胶G——硅胶硅胶+粘合剂煅石膏粘合剂煅石膏           硅胶硅胶GF254——含有荧光物质含有荧光物质           硅胶硅胶H ——不含粘合剂煅石膏不含粘合剂煅石膏           硅胶硅胶HF254 ——含有荧光物质含有荧光物质常用的吸附剂常用的吸附剂——其它其它氧化铝：氧化铝：碱性、中性、酸性三种规格碱性、中性、酸性三种规格聚酰胺：聚酰胺：“氢键吸附氢键吸附”，对羟基类成分有很好的分离效，对羟基类成分有很好的分离效果附子中乌头碱的限量检查，就是采用碱性氧附子中乌头碱的限量检查，就是采用碱性氧化铝制备的薄层板化铝制备的薄层板薄层色谱法薄层色谱法——展开剂的选择展开剂的选择F待测组分的待测组分的Rf值宜控制在值宜控制在0.2-0.8之间之间F各组分斑点圆且集中各组分斑点圆且集中F混合溶剂临用前新鲜配制混合溶剂临用前新鲜配制       要根据被分离物质的溶解性、酸碱性、要根据被分离物质的溶解性、酸碱性、极性等性质，结合吸附剂的吸附性能，综合极性等性质，结合吸附剂的吸附性能，综合考虑，可选择单一溶剂或混合溶剂系统。

考虑，可选择单一溶剂或混合溶剂系统       若分离某些酸性或碱性成分，可在所选若分离某些酸性或碱性成分，可在所选溶剂中加入少量的酸或碱或将一小杯挥发性溶剂中加入少量的酸或碱或将一小杯挥发性酸或碱放置色谱缸内酸或碱放置色谱缸内操作技术操作技术——手工铺板手工铺板         取一份吸附剂和三份水（或另加黏合剂），在研钵取一份吸附剂和三份水（或另加黏合剂），在研钵中中向一个方向研磨向一个方向研磨混合成均匀糊状（无气泡和结块），混合成均匀糊状（无气泡和结块），均匀涂布在薄层板上均匀涂布在薄层板上玻璃板玻璃板层析专用玻璃板，清洗干净层析专用玻璃板，清洗干净用量用量10×20CM，3g硅胶黏合剂黏合剂0.2～～0.5%CMC-NA溶液，溶液，0.3%干燥干燥水平台面，室温下自然完全晾干水平台面，室温下自然完全晾干检查检查表面光滑平整，均匀，无杂质表面光滑平整，均匀，无杂质操作要点CMC-Na溶液的配制溶液的配制F 浓度浓度0.2～～0.5%，一般用，一般用的浓度是的浓度是0.3%F 浓度过稀，使用的时候薄浓度过稀，使用的时候薄层易掉粉层易掉粉F 浓度过大，用硫酸显色加浓度过大，用硫酸显色加热易变黑热易变黑F 使用上清液使用上清液      取蒸馏水取蒸馏水1000ml，在加热并不断，在加热并不断搅拌的条件下，缓慢加入羧甲基纤维搅拌的条件下，缓慢加入羧甲基纤维素钠素钠0.3g，至完全溶解。

静置冷却，，至完全溶解静置冷却，临用前取上清液备用临用前取上清液备用裂开的薄层板不能使用裂开的薄层板不能使用!        操作技术操作技术—活化活化涂布后的薄层先在室温下阴干，至完全干透后，在涂布后的薄层先在室温下阴干，至完全干透后，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用不同薄层活化条件略有不同干燥器中备用不同薄层活化条件略有不同硅胶硅胶        105℃℃-110℃℃         30～～60min氧化铝氧化铝     105℃℃-110℃℃         30min操作技术操作技术——点样点样定量微升毛细管定量微升毛细管薄层点样毛细管薄层点样毛细管       溶液沸点适中，对成分溶解度好（甲醇、乙醇、溶液沸点适中，对成分溶解度好（甲醇、乙醇、氯仿、醋酸乙酯等氯仿、醋酸乙酯等）       斑点不宜过大斑点不宜过大,以小于以小于3mm为宜，采用多次点为宜，采用多次点加法加法点样量应适中点样量应适中毛细点样管或定量毛细点样毛细点样管或定量毛细点样管尽可能往薄层板中间点管尽可能往薄层板中间点操作技术操作技术——展开展开       预先用展开剂将密闭的色谱缸饱和片刻，然后将点预先用展开剂将密闭的色谱缸饱和片刻，然后将点样后的薄层板置缸内支架上，勿与展开剂接触，预饱和样后的薄层板置缸内支架上，勿与展开剂接触，预饱和一定时间，使缸内饱和的展开剂气体达到平衡。

饱和后，一定时间，使缸内饱和的展开剂气体达到平衡饱和后，将薄层板点有试样一端浸入展开剂约将薄层板点有试样一端浸入展开剂约0.5cm深处（不能深处（不能浸泡点样斑点），开始展开，随着展开剂的上升，试样浸泡点样斑点），开始展开，随着展开剂的上升，试样中不同成分因迁移速度不同而得到分离待展开剂上行中不同成分因迁移速度不同而得到分离待展开剂上行迁移到规定高度即取出烘干迁移到规定高度即取出烘干操作技术操作技术——显色显色观察方法：观察方法：日光日光、、荧光荧光、、显色显色通常可先在日光下观察，标出色斑并确定通常可先在日光下观察，标出色斑并确定其位置，然后在紫外光下观察和标记，必其位置，然后在紫外光下观察和标记，必要时再选择显色剂显色观察要时再选择显色剂显色观察若薄层板为硬板，采用喷雾法将显色剂直若薄层板为硬板，采用喷雾法将显色剂直接喷洒；软板可选用碘蒸气法、压板法接喷洒；软板可选用碘蒸气法、压板法显色喷雾瓶显色喷雾瓶三用紫外灯三用紫外灯操作技术操作技术——计算比移值计算比移值0.2-0.8Rf值越大，化合物的极性？值越大，化合物的极性？纸色谱法纸色谱法——定义与原理定义与原理分配色谱分配色谱定义：定义：定义：定义：以滤纸为支持剂，滤纸上吸着的水（或以滤纸为支持剂，滤纸上吸着的水（或根据实际分离的需要，经适当处理后滤纸上吸根据实际分离的需要，经适当处理后滤纸上吸附的溶液）为固定相，用一定的溶剂系统为移附的溶液）为固定相，用一定的溶剂系统为移动相进行展开，利用混合物中各成分分配系数动相进行展开，利用混合物中各成分分配系数的差异而达到分离的一种分配色谱法。

的差异而达到分离的一种分配色谱法纸色谱法纸色谱法——实验所需器材实验所需器材薄层点样毛细管薄层点样毛细管     主要用于亲水性化合物的分离主要用于亲水性化合物的分离如氨基酸、苷类、糖类、有机酸如氨基酸、苷类、糖类、有机酸分类分类吸附柱色谱吸附柱色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱分配柱色谱分配柱色谱离子交换柱色谱离子交换柱色谱      上样量大，常用于制备分离，上样量大，常用于制备分离，是分离天然化学成分最常用的方法是分离天然化学成分最常用的方法       柱色谱是一种将分离材料装入柱状容器中柱色谱是一种将分离材料装入柱状容器中,以以适当的洗脱剂进行洗脱而使不同成分得到分离的适当的洗脱剂进行洗脱而使不同成分得到分离的色谱方法色谱方法柱色谱柱色谱-定义定义吸附柱色谱法吸附柱色谱法—基本原理基本原理吸附吸附作用作用化学吸附化学吸附:碱性氧化铝与黄酮发生的吸附碱性氧化铝与黄酮发生的吸附半化学吸附半化学吸附:氢键吸附，过程可逆氢键吸附，过程可逆物理吸附：相似者易于吸附物理吸附：相似者易于吸附         吸附色吸附色谱最主要的谱最主要的吸附力吸附力      利用作为固定相的吸附剂对混合利用作为固定相的吸附剂对混合物物中各种成分吸中各种成分吸附能力的大小不同，使各种成分得到相互分离的方法。

附能力的大小不同，使各种成分得到相互分离的方法物理吸附物理吸附化学吸附化学吸附半化学吸附半化学吸附       溶液分子与吸溶液分子与吸附剂表面分子的分附剂表面分子的分子间作用力子间作用力      硅胶、氧化铝及硅胶、氧化铝及活性炭为吸附剂的活性炭为吸附剂的吸附色谱吸附色谱      如聚酰胺与如聚酰胺与黄酮类、蒽醌类黄酮类、蒽醌类等化合物之间的等化合物之间的氢键吸附介于氢键吸附介于物理吸附与化学物理吸附与化学吸附之间吸附之间 如黄酮等酚酸如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化性物质被碱性氧化铝吸附，生物碱被铝吸附，生物碱被酸性硅胶吸附等酸性硅胶吸附等物理吸附基本规律物理吸附基本规律→相似者易吸附相似者易吸附       固液吸附三要素：吸附剂、溶质、溶剂固液吸附三要素：吸附剂、溶质、溶剂极性吸附剂极性吸附剂非极性吸附剂非极性吸附剂       对非极性物质亲对非极性物质亲和能力强，溶剂极性和能力强，溶剂极性降低，则活性炭对溶降低，则活性炭对溶质的吸附能力也随之质的吸附能力也随之降低；反之，则提高降低；反之，则提高 a.对极性强的物质吸附能对极性强的物质吸附能力强力强 b.溶剂极性减弱，则吸附溶剂极性减弱，则吸附剂对溶质的吸附能力增强；剂对溶质的吸附能力增强；反之，则减弱。

反之，则减弱c.溶质即使被硅胶、氧化铝溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，一旦加入极性较强的吸附，一旦加入极性较强的溶剂时，又可被置换洗脱下溶剂时，又可被置换洗脱下来来    常用于分离水溶性成分常用于分离水溶性成分如氨基酸、糖类及某些苷如氨基酸、糖类及某些苷类！类！洗脱剂洗脱剂聚酰胺聚酰胺操作步骤操作步骤：：装柱装柱上样上样洗脱洗脱常用的吸附剂常用的吸附剂——聚酰胺聚酰胺      聚酰胺是通过酰胺基聚合而成的一类高分聚酰胺是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有丰富酰胺基，可与酚子化合物，分子中含有丰富酰胺基，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键氢键结结合而被吸附，根据吸附力的大小不同，使能合而被吸附，根据吸附力的大小不同，使能形成氢键与不能形成氢键的化合物达到分离形成氢键与不能形成氢键的化合物达到分离氢键吸附氢键吸附聚酰胺吸附能力强弱的判断聚酰胺吸附能力强弱的判断溶剂的种类溶剂的种类水、有机溶剂、碱溶液水、有机溶剂、碱溶液化合物分子结构化合物分子结构分子中能形成氢键的基团越多，吸附越强分子中能形成氢键的基团越多，吸附越强成键基团位置不同，被吸附的强弱也不同成键基团位置不同，被吸附的强弱也不同共轭双键越多，吸附越强共轭双键越多，吸附越强能形成分子内氢键者被吸附强度减弱能形成分子内氢键者被吸附强度减弱化合物结构对化合物结构对聚酰胺吸附作聚酰胺吸附作用的影响用的影响形成氢键的数目形成氢键的数目成键基团位置成键基团位置双键的数目双键的数目分子内氢键分子内氢键吸附柱色谱吸附柱色谱——流动相流动相极性吸附剂极性吸附剂溶剂极性越大，洗脱能力越强溶剂极性越大，洗脱能力越强 非极性吸附剂非极性吸附剂水、水、l0%乙醇、乙醇、20%乙醇、乙醇、 30%乙醇、乙醇、50%乙醇、乙醇、75%乙醇、乙醇、95%乙醇乙醇 聚酰胺聚酰胺水、乙醇（水、乙醇（30%、、50%、、75%、、95%）、丙）、丙酮、稀氨水液或稀氢氧化钠水液、甲酰胺或酮、稀氨水液或稀氢氧化钠水液、甲酰胺或二甲基甲酰胺、尿素水溶液二甲基甲酰胺、尿素水溶液 吸附柱色谱吸附柱色谱——被分离物质被分离物质       在吸附剂与洗脱剂固定的情况下，各组分分离在吸附剂与洗脱剂固定的情况下，各组分分离的情况直接与化合物的结构与性质有关。

的情况直接与化合物的结构与性质有关       硅胶和氧化铝（极性吸附剂）硅胶和氧化铝（极性吸附剂），，极性越大，极性越大，被吸附就越强！被吸附就越强！F 柱层析吸附剂一般是柱层析吸附剂一般是100-200100-200目目F 试样与吸附剂用量比约为试样与吸附剂用量比约为1:601:60F 可分为湿法装柱和干法装柱可分为湿法装柱和干法装柱吸附柱色谱吸附柱色谱——装柱装柱要求要求      柱中吸附剂充填均匀，柱体内柱中吸附剂充填均匀，柱体内不得出现气泡、疏密不匀或者裂缝！不得出现气泡、疏密不匀或者裂缝！F 湿法上样：湿法上样：洗脱剂溶解试样制成高洗脱剂溶解试样制成高       浓度溶液浓度溶液F 干法上样：干法上样：试样层尽量窄且平整试样层尽量窄且平整吸附柱色谱吸附柱色谱——上样上样吸附柱色谱吸附柱色谱——洗脱洗脱F 参照薄层色谱确定色谱条件：参照薄层色谱确定色谱条件：Rf约为约为0.2F 梯度洗脱梯度洗脱F 注意保持液面高度，勿使柱面洗脱液流干注意保持液面高度，勿使柱面洗脱液流干F 化合物无色，等份收集化合物无色，等份收集+薄层鉴别薄层鉴别分配色谱法分配色谱法分配色谱法分配色谱法基本原理基本原理(分配系数不同分配系数不同)正正相相分分配配色色谱谱反反相相分分配配色色谱谱正相正相色谱色谱极性物质吸附强极性物质吸附强非极性物质吸附弱非极性物质吸附弱后出后出先出先出反相反相色谱色谱极性物质吸附弱极性物质吸附弱非极性物质吸附强非极性物质吸附强先出先出后出后出分配柱色谱法分配柱色谱法—基本原理基本原理反向分配色谱反向分配色谱                             正向分配色谱正向分配色谱     支持剂：支持剂：硅胶，硅胶，溶剂系统溶剂系统：水饱和的正丁醇，：水饱和的正丁醇，         水为水为固定相固定相，正丁醇为，正丁醇为移动相移动相。

      反相硅胶：在硅胶表面键合长度不同的烷基反相硅胶：在硅胶表面键合长度不同的烷基R，形成亲油表面而成烷基长度为乙基、辛基、，形成亲油表面而成烷基长度为乙基、辛基、十八烷基十八烷基      溶剂：溶剂：H2O-MeOH、、H2O-CH3CN离子交换色谱法离子交换色谱法—定义、定义、 分类分类       是一种利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液中与是一种利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液中与溶液的其他离子进行可逆交换的性质，以离子交换树脂作溶液的其他离子进行可逆交换的性质，以离子交换树脂作为固定相，使混合成分中离子型与非离子型物质、或具有为固定相，使混合成分中离子型与非离子型物质、或具有不同解离度的离子化合物得到分离的方法不同解离度的离子化合物得到分离的方法 阳离子交换树脂：被分离物质带正电荷阳离子交换树脂：被分离物质带正电荷阴离子交换树脂：被分离物质带负电荷阴离子交换树脂：被分离物质带负电荷分类分类氨基酸的离子交换分离原理氨基酸的离子交换分离原理离子交换柱色谱离子交换柱色谱——操作技术操作技术树脂的预处理树脂的预处理 装柱装柱 上样上样 洗脱洗脱 再生再生 定义定义       以凝胶作为固定相，选择适当的溶剂进行洗脱，使混合以凝胶作为固定相，选择适当的溶剂进行洗脱，使混合物分子中分子量大小不同的化合物得到分离的方法物分子中分子量大小不同的化合物得到分离的方法分离原理分离原理 葡聚糖凝胶是由葡聚糖和甘油基通过醚桥相交链而成的葡聚糖凝胶是由葡聚糖和甘油基通过醚桥相交链而成的多孔性网状结构。

多孔性网状结构 凝胶吸水后形成凝胶粒子，凝胶粒子构成网眼，小分子凝胶吸水后形成凝胶粒子，凝胶粒子构成网眼，小分子进入，大分子流下如同按照分子大小过筛一样，故称为进入，大分子流下如同按照分子大小过筛一样，故称为“筛层析筛层析” 凝胶层析凝胶层析• 凝胶凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外   •凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等，依据是多孔的多孔的载体对不同体载体对不同体积和不同形状积和不同形状分子的排阻能分子的排阻能力的不同力的不同，，从而对混合物进行分离凝胶层析凝胶层析    表面有孔隙，其大小决定于聚糖与交联剂表面有孔隙，其大小决定于聚糖与交联剂的配比及反应条件的配比及反应条件 商品型号即按凝胶的交联度大小分类，并商品型号即按凝胶的交联度大小分类，并以吸水量来表示，英文字母以吸水量来表示，英文字母G代表葡聚糖凝胶，代表葡聚糖凝胶，后面的数字表示每克凝胶吸水量，再乘以后面的数字表示每克凝胶吸水量，再乘以10的的值，值，G-25的吸水量为每克的吸水量为每克2.5ml。

        交联度大交联度大→网状结构越紧密网状结构越紧密→孔隙越小孔隙越小→吸吸水膨胀越少水膨胀越少大分子化合物大分子化合物阻力较小，流速较快阻力较小，流速较快小分子化合物小分子化合物阻力较大，流速较慢阻力较大，流速较慢凝胶色谱原理示意图凝胶色谱原理示意图 此法常用的凝胶有葡聚糖凝胶（此法常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）和羟）和羟丙基葡聚糖凝胶丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)前者只适用于在水中前者只适用于在水中应用，而后者不但可在水中用，也可在有机溶剂中用或在水与应用，而后者不但可在水中用，也可在有机溶剂中用或在水与有机溶剂的混合溶剂中使用有机溶剂的混合溶剂中使用 G型凝胶：水或含水醇上样、洗脱型凝胶：水或含水醇上样、洗脱——分离水溶性大分子分离水溶性大分子化合物 Sephadex LH-20凝胶（引入羟丙基）：可用有机溶剂凝胶（引入羟丙基）：可用有机溶剂——极性大、极性小化合物均可分离极性大、极性小化合物均可分离凝胶层析凝胶层析凝胶柱层析的动态过程凝胶柱层析的动态过程大孔吸附树脂层析法大孔吸附树脂层析法    大孔树脂的多孔网状结构，巨大的比表面积使其大孔树脂的多孔网状结构，巨大的比表面积使其具有良好的吸附性能具有良好的吸附性能的的白色的颗粒状物质白色的颗粒状物质。

吸附原理吸附原理       大孔吸附树脂通过物理吸附（范德华引力或大孔吸附树脂通过物理吸附（范德华引力或氢键）和分子筛作用（多孔网状结构）而实现分氢键）和分子筛作用（多孔网状结构）而实现分离；离；           极性较大的化合物一般适用于中极性的树脂上极性较大的化合物一般适用于中极性的树脂上分离      极性较小的化合物一般适用于非极性的树脂上极性较小的化合物一般适用于非极性的树脂上分离洗脱液的选择洗脱液的选择        洗脱剂选择基本要求依据洗脱剂选择基本要求依据“相似相溶相似相溶”原理可选用水、不同浓度的可选用水、不同浓度的MeOH、、EtOH、、Me2CO      非极性大孔树脂非极性大孔树脂 ——洗脱剂极性越小，洗洗脱剂极性越小，洗脱能力越强脱能力越强      中极性大孔树脂中极性大孔树脂 ——用极性较大有机溶剂用极性较大有机溶剂洗脱洗脱大孔树脂预处理与再生大孔树脂预处理与再生 预处理：预处理：MeOH 或或Me2CO浸泡过夜，装柱后连续浸泡过夜，装柱后连续洗涤至流出液加等量水无浑浊洗涤至流出液加等量水无浑浊 再生：再生：乙醇浸泡乙醇浸泡24小时，小时，用乙醇用乙醇洗涤，至醇液中洗涤，至醇液中加水不呈白色混浊止。

加水不呈白色混浊止用用2% NaOH浸泡、洗涤，水浸泡、洗涤，水洗至中性，再用洗至中性，再用5% HCl浸泡、洗涤，然后水洗至中浸泡、洗涤，然后水洗至中性 另外，其存放时，应保持颗粒湿润，否则一旦颗另外，其存放时，应保持颗粒湿润，否则一旦颗粒干了则颗粒易碎，此时则大孔树脂不能使用了粒干了则颗粒易碎，此时则大孔树脂不能使用了大孔吸附树脂柱的洗脱大孔吸附树脂柱的洗脱洗洗 脱脱 柱柱得得3 3瓶洗脱液瓶洗脱液2020％％3030％％9595％％硅胶柱硅胶柱气相色谱法气相色谱法 气相色谱与液相色谱相似，只是以气相色谱与液相色谱相似，只是以气体作流动气体作流动相相，它的分离机理是基于物质在流动气相和固定相，它的分离机理是基于物质在流动气相和固定相（可为固体和液体）两相间分配的不同而达到分离（可为固体和液体）两相间分配的不同而达到分离的方法 农药残留等的检测农药残留等的检测载气系统载气系统进样系统进样系统色谱柱色谱柱检测系统检测系统温控系统温控系统高效液相色谱法高效液相色谱法 高效液相色谱的原理与一般液相色谱十分相似，样品高效液相色谱的原理与一般液相色谱十分相似，样品的分离取决于其在流动相和固定相中的分配。

的分离取决于其在流动相和固定相中的分配 特点是使用高压输液泵进行洗脱，并配备有紫外等检特点是使用高压输液泵进行洗脱，并配备有紫外等检测系统，使分离达到高速化和高效化测系统，使分离达到高速化和高效化    第三节第三节    天然产物的结构鉴定天然产物的结构鉴定 鉴定天然产物所需做的工作鉴定天然产物所需做的工作1 1、元素分析、元素分析 由哪些元素组成，各占多少由哪些元素组成，各占多少2 2、物理常数、物理常数 熔、沸点熔、沸点3 3、比旋光度、比旋光度4 4、分子量、凝胶过滤法、光散射法、粘度测定、分子量、凝胶过滤法、光散射法、粘度测定法、法、MSMS等方法等方法5 5、结构测定法：红外光谱、核磁共振（、结构测定法：红外光谱、核磁共振（1313C C谱谱 、、1 1H H谱和二维谱）谱和二维谱）结构测定的一般程序纯度鉴定纯度鉴定推测母体结构类型推测母体结构类型功能基情况功能基情况分子量分子式的确定分子量分子式的确定波谱、化学方法波谱、化学方法推测出结构式推测出结构式人工合成进行确认人工合成进行确认结构测定    一、化学方法一、化学方法 二、仪器方法二、仪器方法 波长在波长在200~400nm分子吸收紫外线引起分子分子吸收紫外线引起分子价键电子跃迁，由于价电子跃迁的能级固不同的价键电子跃迁，由于价电子跃迁的能级固不同的而各异。

而各异 1、紫外光谱、紫外光谱①① 饱和饱和σ键键σ→ σ* 跃迁，不出现吸收带跃迁，不出现吸收带②②共轭双键共轭双键 π →π *和和n →π*跃迁 紫外主要用于是否含有共轭体系的鉴定，如紫外主要用于是否含有共轭体系的鉴定，如苯在苯在256nm出现出现B带    OH 3600cm-1左右，因缔合，峰较宽；左右，因缔合，峰较宽；C=O 1700cm-1附近，随所连基团的供电子强弱附近，随所连基团的供电子强弱而向上或向下移动而向上或向下移动 2、红外光谱、红外光谱测定分子中存在的官能团种类测定分子中存在的官能团种类   3、质谱、质谱 确定分子量确定分子量4、氢核磁共振谱、氢核磁共振谱 确定氢的个数及相互关系确定氢的个数及相互关系5、旋光光谱、旋光光谱 具有旋光性的天然产物，测定其构型和构象具有旋光性的天然产物，测定其构型和构象6、元素分析、元素分析 测定测定C、、H、、N、、S元素含量元素含量7、、 核磁共振谱核磁共振谱 确定分子骨架确定分子骨架      酚酚UV280nm，，IR1500~1600、、3300cm-1，溶于，溶于NaOH黄酮黄酮 黄色或淡黄结晶，黄色或淡黄结晶，UV240~285nm及及300~400nm各一各一峰，峰，IR在在1500~1700cm-1有吸收。

有吸收皂甙皂甙1H谱在高场有山峰形及几个甲基尖峰信号谱在高场有山峰形及几个甲基尖峰信号香豆素香豆素UV240~260nm，，IR1500~1600cm-1，有芳环吸收；，有芳环吸收； 320nm吡喃酮环结构，吡喃酮环结构， 1700cm-1附近有不饱和内酯附近有不饱和内酯吸收峰吸收峰 ；；1H谱主要为芳香质子信号谱主要为芳香质子信号    三、中药指纹图谱质量控制三、中药指纹图谱质量控制        借助计算机、信息及先进的物理、化学技术，借助计算机、信息及先进的物理、化学技术，将中药的特性和有效成分，采用图谱的形式描将中药的特性和有效成分，采用图谱的形式描绘出来，从而鉴定真伪、辨认优劣、确定其质绘出来，从而鉴定真伪、辨认优劣、确定其质量和有效性量和有效性 红外光谱指纹图谱红外光谱指纹图谱高效液相色谱高效液相色谱-质谱指纹图谱质谱指纹图谱气相色谱气相色谱-质谱指纹图谱质谱指纹图谱质谱指纹图谱质谱指纹图谱 紫外光谱指纹图谱紫外光谱指纹图谱X-射线衍射指纹图谱射线衍射指纹图谱包括：包括：   柚肉汁提取成分的高效液相色谱指纹图谱柚肉汁提取成分的高效液相色谱指纹图谱          植物药是多种化学成分的混合体，其药效不植物药是多种化学成分的混合体，其药效不是单一的组份能说明的，是多种活性组份共同起是单一的组份能说明的，是多种活性组份共同起作用的，因此单一活性组份的测定和评价不能说作用的，因此单一活性组份的测定和评价不能说明中药质量的好坏，而且目前很多检测的指标成明中药质量的好坏，而且目前很多检测的指标成分不具唯一性，将西药检测的理念完全应用于中分不具唯一性，将西药检测的理念完全应用于中药存在以偏盖全，割离整体作用的问题。

药存在以偏盖全，割离整体作用的问题         植物药材的质量随产地、气候、生产工艺而植物药材的质量随产地、气候、生产工艺而不同，建立一种代表性的整体性识别方式，将各不同，建立一种代表性的整体性识别方式，将各种共同的特征用一个图谱表现出来受到重视种共同的特征用一个图谱表现出来受到重视            指纹图谱是在某一方面从整体上来确定特定指纹图谱是在某一方面从整体上来确定特定研究对象（如中药材，提取物，饮片，注射液等）研究对象（如中药材，提取物，饮片，注射液等）组成的一种方法，是一种模糊识辨方式比较适组成的一种方法，是一种模糊识辨方式比较适合于中药这种复杂体系的表征合于中药这种复杂体系的表征但其也有局限性：但其也有局限性：1、图谱反映的内容不够全面图谱反映的内容不够全面2、图谱与具体的成分结构还有一定的差距图谱与具体的成分结构还有一定的差距        应用某种实用的方法，找出代表性相对更应用某种实用的方法，找出代表性相对更强的图谱进行表征是指纹图谱研究的重点强的图谱进行表征是指纹图谱研究的重点 第四节第四节 结构研究法结构研究法•一、一、纯度的测定纯度的测定•二、二、结构研究的主要程序结构研究的主要程序•三、三、结构研究中采用的主要方法结构研究中采用的主要方法一、纯度的测定一、纯度的测定•纯度检查法：纯度检查法：•均一的晶形均一的晶形•敏锐的熔点、沸点、折光率、比旋度敏锐的熔点、沸点、折光率、比旋度•TLCTLC、、PCPC、、GCGC、、HPLCHPLC二、结构研究的主要程序二、结构研究的主要程序三、结构研究中采用的主要方法三、结构研究中采用的主要方法•1. 1. 确定分子式，计算不饱和度确定分子式，计算不饱和度•2. 2. 质谱质谱 （（MSMS，，mass spectrummass spectrum））•3. 3. 红外光谱红外光谱（（IRIR，，infrared spectrainfrared spectra））•4. 4. 紫外紫外- -可见吸收光谱可见吸收光谱（（UV-UV-visvis) ) (ultraviolet-visible (ultraviolet-visible spectraspectra））•5. 5. 核磁共振核磁共振（（NMRNMR，，nuclear magnetic nuclear magnetic resonanceresonance））•6. 6. 其他：其他： x-x-单晶衍射法单晶衍射法 旋光光谱（旋光光谱（ORDORD）） 园二色谱（园二色谱（CDCD）） 三、结构研究中采用的主要方法三、结构研究中采用的主要方法—— 1. 1. 确定分子式，计算不饱和度确定分子式，计算不饱和度•分子式的确定分子式的确定•元素定量分析结合分子量测定元素定量分析结合分子量测定•同位素丰度比法同位素丰度比法•高分辨质谱（高分辨质谱（HR-MSHR-MS，，high resolution mass spectrum high resolution mass spectrum ）） •不饱和度的计算不饱和度的计算•u=Ⅳu=Ⅳ－－Ⅰ/2Ⅰ/2＋＋Ⅲ/2Ⅲ/2＋＋1 Ⅰ1 Ⅰ：一价原子数：一价原子数 如如H H、、X X Ⅲ Ⅲ：三价原子数，如：三价原子数，如N N、、P P Ⅳ Ⅳ：四价原子数，如：四价原子数，如C C三、结构研究中采用的主要方法三、结构研究中采用的主要方法—— 2. 2. 质谱质谱 （（MSMS，，mass spectrummass spectrum））•作用：作用：p确定分子量、分子式确定分子量、分子式p提供部分结构信息提供部分结构信息 ————丢失碎片的大小丢失碎片的大小 如如1515、、1717 —— ——碎片的碎片的m/zm/z及裂解方式及裂解方式三、结构研究中采用的主要方法三、结构研究中采用的主要方法—— 2. 2. 质谱质谱 （（MSMS，，mass spectrummass spectrum））•常用质谱技术及特点常用质谱技术及特点•电子轰击质谱（EI-MS，electron impact ionization）•场解析质谱（FD-MS，field desorption ionization） •快速原子轰击质谱（FAB-MS，fast atom bombardment）•电喷雾质谱（ESI-MS，electrospray ionization） •基质辅助激光解析质谱（MALDI-MS） matrix-assisted laser desorption ionization 常用质谱技术及特点常用质谱技术及特点————电子轰击质谱电子轰击质谱（（EI-EI-MSMS））（（electron impact ionizationelectron impact ionization））•样品需加热气化，离化，得到样品需加热气化，离化，得到M M+ +•难气化、易热解的成份测不到难气化、易热解的成份测不到M M+ + 如糖、苷、氨基酸、肽、蛋白、核酸、抗生素如糖、苷、氨基酸、肽、蛋白、核酸、抗生素 常用质谱技术及特点常用质谱技术及特点————场解析质谱场解析质谱（（FD-MSFD-MS））•试样稀液涂于钨丝上作阳极，对面加阴极，通高压，使电试样稀液涂于钨丝上作阳极，对面加阴极，通高压，使电离离•难气化、易热解的成份，可得到难气化、易热解的成份，可得到 分子离子相关峰：分子离子相关峰：[M[M＋＋H]H]+ +、、[M[M＋＋Na]Na]+ +、、[M[M＋＋K]K]+ + 逐个脱去糖基的碎片峰：逐个脱去糖基的碎片峰：[M[M＋＋H-162]H-162]+ +、、[M[M＋＋H-162-H-162-146]146]+ +•苷元的碎片离子相对少苷元的碎片离子相对少常用质谱技术及特点常用质谱技术及特点————快速原子轰击质谱（快速原子轰击质谱（FAB-MSFAB-MS））p离子枪发射高能离子与另一中性粒子碰撞，交换电荷，离子枪发射高能离子与另一中性粒子碰撞，交换电荷， 形成高速中性粒子，与样品碰撞，使其电离形成高速中性粒子，与样品碰撞，使其电离p难气化、易热解的成份，可得到难气化、易热解的成份，可得到 分子离子相关峰：分子离子相关峰：[M[M＋＋H]H]+ +、、[M[M＋＋Na]Na]+ +、、[M[M＋＋K]K]+ + 逐个脱去糖基的碎片峰：逐个脱去糖基的碎片峰：[M[M＋＋H-162]H-162]+ +、、[M[M＋＋H-162-H-162-146]146]+ + p可得到苷元的碎片可得到苷元的碎片常用质谱技术及特点常用质谱技术及特点————电喷雾质谱（电喷雾质谱（ESI-MSESI-MS））p强静电场使试样电离，强静电场使试样电离，p难气化、易热解、大分子、小分子，均可得到难气化、易热解、大分子、小分子，均可得到 分子离子相关峰：分子离子相关峰：[M[M＋＋H]H]+ +、、[M[M＋＋Na]Na]+ +、、[M[M＋＋K]K]+ + 常用质谱技术及特点常用质谱技术及特点————基质辅助激光解析质谱（基质辅助激光解析质谱（MALDI-MSMALDI-MS））p用于研究结构复杂，不易气化的大分子物质的分用于研究结构复杂，不易气化的大分子物质的分子量子量 如多糖、蛋白、核酸等如多糖、蛋白、核酸等 三、结构研究中采用的主要方法三、结构研究中采用的主要方法—— 3. 3. 红外光谱（红外光谱（IRIR））•原理：原理： 化学键的振动在红外光区（化学键的振动在红外光区（40004000～～625cm625cm-1-1））引起的吸收谱图引起的吸收谱图•作用：作用：• 特征频率区（特征频率区（ 40004000～～1500 cm1500 cm-1-1 ）） —— —— 确定官能团类型确定官能团类型•指纹区（指纹区（ 15001500～～600 cm600 cm-1-1 ）） —— —— 构象、构型、取代模式等构象、构型、取代模式等三、结构研究中采用的主要方法三、结构研究中采用的主要方法—— 4. 4. 紫外紫外- -可见吸收光谱（可见吸收光谱（UV-UV-visvis) )•原理原理 电子由基态跃迁至激发态（电子由基态跃迁至激发态（、、n n）） 在紫外可见光区（在紫外可见光区（200200～～700nm700nm）引起的吸收谱图）引起的吸收谱图•作用作用•对含有共轭双键、对含有共轭双键、α,βα,β- -不饱和羰基、芳香化合物的结构鉴定有重要不饱和羰基、芳香化合物的结构鉴定有重要价值价值•特定的吸收谱特征特定的吸收谱特征————骨架类型的判断骨架类型的判断 如：黄酮、香豆素、蒽醌如：黄酮、香豆素、蒽醌•加诊断试剂前后谱图的规律性变化加诊断试剂前后谱图的规律性变化————取代图式的推断取代图式的推断 如：黄酮、香豆素如：黄酮、香豆素三、结构研究中采用的主要方法三、结构研究中采用的主要方法——5. 5. 核磁共振（核磁共振（NMRNMR））•原理：原理： 1 1H H、、1313C C等具有磁矩的原子在外加磁场中受电磁波照射，等具有磁矩的原子在外加磁场中受电磁波照射，吸收一定能量电磁波，产生能级变化，引起核磁共振吸收一定能量电磁波，产生能级变化，引起核磁共振•氢核磁共振（氢核磁共振（1 1H-NMRH-NMR））•碳核磁共振谱（碳核磁共振谱（1313C-NMRC-NMR））•二维核磁共振谱二维核磁共振谱 （（2D-NMR2D-NMR））氢核磁共振（氢核磁共振（1 1H-NMRH-NMR））n 应用：应用： 提供提供H H的类型、数目、相邻原子团的信息的类型、数目、相邻原子团的信息n 四个参数：四个参数：•化学位移（化学位移（ ）：）：1 1～～1010～～20ppm ——H20ppm ——H的类型的类型 屏蔽效应屏蔽效应•积分值积分值/ /积分面积积分面积 ——————同一环境下同一环境下H H的个数的个数•自旋偶合裂分的峰数自旋偶合裂分的峰数 ——————邻位与其不等同的邻位与其不等同的H H的个数的个数 符合符合 n+1n+1律律 s, d, t, qs, d, t, q•偶合常数（偶合常数（J J）） ———H———H核间的距离核间的距离 相隔键数：相隔键数： 越少，越少，J J大，通常为大，通常为3 3J JH-HH-H 二面角：二面角： 越接近越接近90°90°，，J J越小越小 越接近越接近0°0°、、180°180°，，J J越大越大氢核磁共振（氢核磁共振（1 1H-NMRH-NMR））n 远程偶合远程偶合( (4 4J JH-HH-H) )：： JacJac=1.6=1.6～～2.0Hz2.0HzJbcJbc=0=0～～1.5Hz1.5Hz烯丙偶合烯丙偶合芳环上的偶合芳环上的偶合Jab=6Jab=6～～10 Hz10 HzJacJac=1=1～～3Hz3HzJadJad=0=0～～1 Hz1 Hz氢核磁共振（氢核磁共振（1 1H-NMRH-NMR））•同核去偶技术（同核去偶技术（homodecouplinghomodecoupling）：）： 消除或部分消除相邻消除或部分消除相邻H H核的偶合，简化图谱核的偶合，简化图谱 CHCH3 3CHCH2 2OCOOCOCHCH3 3CH3 t 照射H-2 sCH2 q 照射H-1 sCH3 s碳核磁共振谱（碳核磁共振谱（1313C-NMRC-NMR））•最重要的参数：最重要的参数： 化学位移化学位移 ：：1 1～～200ppm ——C200ppm ——C的类型的类型 •1313C C的信号裂分的信号裂分 1313C-NMRC-NMR：异核偶合：异核偶合————1 1H-NMRH-NMR：同核偶合：同核偶合•偶合裂分峰数：偶合裂分峰数：——C——C的级别的级别 符合符合n+1n+1律，律，s, d, t, qs, d, t, q，，•有有1 1J JC-HC-H 2 2J JC-HC-H 3 3J JC-HC-H碳核磁共振谱（碳核磁共振谱（1313C-NMRC-NMR））•常见碳谱类型及特征：常见碳谱类型及特征： •噪音去偶谱噪音去偶谱（（proton noise decoupling spectrumproton noise decoupling spectrum）） 全氢去偶全氢去偶（（COMCOM，，proton complete decouplingproton complete decoupling）） 宽带去偶宽带去偶（（BBDBBD，，broad band decouplingbroad band decoupling）） •选择氢核去偶谱选择氢核去偶谱（（SPDSPD）） selective proton decoupling spectrumselective proton decoupling spectrum 远程选择氢核去偶谱远程选择氢核去偶谱（（LSPDLSPD）） long range selective proton decoupling long range selective proton decoupling spectrumspectrum•无畸变极化转移增强法无畸变极化转移增强法(DEPT(DEPT）） distortionlessdistortionless enhancement by polarization enhancement by polarization transfer transfer 常见碳谱类型及特征常见碳谱类型及特征————噪音去偶谱噪音去偶谱•噪音去偶谱噪音去偶谱（（proton noise decoupling spectrumproton noise decoupling spectrum）） 全氢去偶全氢去偶（（COMCOM，，proton complete decouplingproton complete decoupling）） 宽带去偶宽带去偶（（BBDBBD，，broad band decouplingbroad band decoupling））p宽频照射，消除所有宽频照射，消除所有H H对对C C的偶合的偶合p谱中所有谱中所有C C均为均为s sp无对称因素强况下，谱中信号数即无对称因素强况下，谱中信号数即C C数数常见碳谱类型及特征常见碳谱类型及特征————选择氢核去偶谱选择氢核去偶谱 远程选择氢核去偶远程选择氢核去偶谱谱•选择氢核去偶谱（选择氢核去偶谱（SPDSPD）） selective proton decoupling spectrum selective proton decoupling spectrum 远程选择氢核去偶谱（远程选择氢核去偶谱（LSPDLSPD）） long range selective proton decoupling long range selective proton decoupling spectrumspectrum•照射某个或某几个H，消除部分H对C的偶合•谱中，与被照射H偶合的C信号不同程度简化以以9-C9-C为例为例常见碳谱类型及特征常见碳谱类型及特征————无畸变极化转移无畸变极化转移增强法增强法•无畸变极化转移增强法无畸变极化转移增强法(DEPT(DEPT）） distortionlessdistortionless enhancement by polarization enhancement by polarization transfer transfer •改变照射改变照射1 1H H的脉冲宽度（的脉冲宽度（ ））•所有所有1313C C信号均为单峰信号均为单峰•不同类型不同类型1313C C分别呈正峰、倒峰分别呈正峰、倒峰 •如如  =45°，，CH，，CH2，，CH3 正峰正峰•     =90°，，CH 正峰正峰•     =135°，，CH，，CH3，正峰，，正峰，CH2  倒峰倒峰 二维核磁共振（二维核磁共振（2D-NMR2D-NMR）） •1 1H-H-1 1H H相关谱相关谱 （（1 1H-H-1 1H COSYH COSY）） 1 1H-H-1 1H correlation spectroscopyH correlation spectroscopy•1313C-C-1 1H H相关谱相关谱 （（1313C-C-1 1H H COSYCOSY）） ————异核多量子相关谱（异核多量子相关谱（HMQCHMQC）） ( (1 1H-detected H-detected heteronuclearheteronuclear multiple quantum multiple quantum coherence)coherence)•1313C-C-1 1H H远程远程相关谱（相关谱（ LrLr. . 1313C-C-1 1H COSYH COSY）） ————异核多键相关谱（异核多键相关谱（HMBCHMBC））（（1 1H-detected H-detected heteronuclearheteronuclear multiple bond multiple bond corerelationcorerelation））二维核磁共振（二维核磁共振（2D-NMR2D-NMR））————1 1H-H-1 1H H相关谱相关谱 （（1 1H-H-1 1H COSYH COSY）） • 对角峰：同一个对角峰：同一个1 1H H出现对角峰出现对角峰• 相关峰：相互偶合的相关峰：相互偶合的1 1H H出现相关峰出现相关峰• 用来归属相互偶合的用来归属相互偶合的1 1H H信号，推断官能团的连接方式信号，推断官能团的连接方式 对角峰相关峰二维核磁共振（二维核磁共振（2D-NMR2D-NMR））————1313C-C-1 1H H相关谱相关谱 （（1313C-C-1 1H H COSYCOSY））•异核多量子相关谱（异核多量子相关谱（HMQCHMQC））•1 1J JC-HC-H ，，1 1H H和与其直接相连的和与其直接相连的1313C C出现相关峰出现相关峰•用来进行信号归属，判断碳的级别用来进行信号归属，判断碳的级别 二维核磁共振（二维核磁共振（2D-NMR2D-NMR））————1313C-C-1 1H H远程远程相关谱相关谱 （（LrLr. . 1313C-C-1 1H H COSYCOSY））•异核多键相关谱（异核多键相关谱（HMBCHMBC））•3 3J JC-HC-H ，，1 1H H和与其相隔和与其相隔3 3个化学键的个化学键的1313C C出现相关出现相关峰峰•用来进行信号归属，判断碳的级别用来进行信号归属，判断碳的级别 。