质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定.docx

质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定组员：孙慜、孙苏、谢拓燕、郑倩倩、王佳玲 【实验目的】1、 了解DNA的限制性内切酶酶切的基本原理2、 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术【实验原理】① DNA的限制性内切酶酶切原理⑴限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特 异位点上，并切割双链DNA，但不能切单链DNA它可分为三类:1类和III类酶在同一蛋白 质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在III类酶结合于识别位点并随 机的切割识别位点不远处的DNA,而III类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离 II类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另 一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列II类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了 广泛应用，它们是重组DNA的基础绝大多数II类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列（如EcoR I识别六个核苷酸序列:5 ‘- G ； AATTC-3 '）,有少数酶识别 更长的序列或简并序列II类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端 的DNA片段（如SmaI :5 '-CCC/GGG-3 ‘）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突 出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoR I切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5 '•••G/AATTC—3 ‘ —5 '…G AATTC-3 ‘3 '•••CTTAAfG -5 ‘ —3 '…CTTAA G-5 ‘DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶 酶切位点组成，以直线或环状图式表示在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的 无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来 发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上② 琼脂糖凝胶电泳条带的观察：⑵通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁 移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同当迁移足够距离后，就可以通过 Gelview染色来观察DNA片断Gelview是一种荧光染料它可以在做胶时混入其中在电泳 时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview溶液中进行染色但必须 将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察③ 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分离：⑵DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的pH 溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量 的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。

在一定的电场强 度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的构型和大小具有不同分 子质量或者不同构型的DNA分子泳动速率不一样，可以进行分离未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂 糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的质粒DNA以下列三种主要构 象中的任何一种形式存在：1、超螺旋DNA：尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围 形成一种致密的结构这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最 快2、 线性DNA：当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这 种DNA的泳动速率介于超螺旋与切口质粒DNA之间3、 开环DNA：在质粒DNA复制过程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解 开质粒的超螺旋在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中 引入切口从而产生松散的开环结构这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式 阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动实验仪器和试剂】(3)一、试剂1、 EcoR I 酶解缓冲液(10X)： lmol/L,pH=7.5 Tris-HCl;0.5mol/L NaCl;0.1mol/L MgC］。

2、 TEB缓冲溶液(5X)：称取Tris 10.88g,硼酸5.52g和EDTA-Na20.72g，用蒸馏水溶解后， 定容至 200mL，即配成 89mmol/L Tris,89mmol/L硼酸，2mmol/L EDTA pH=8.3(5X)的 TEB 缓 冲溶液使用时，用蒸馏水稀释10倍，称为TEB稀释缓冲溶液(0.5XTBE)3、 样品缓冲溶液(10X)： 0.25%溴酚蓝，0.25%FF, 40%蔗糖水溶液(W/V)(或用30%甘 油水溶液)4 菲啶溴红染色液5、 EcoR I 酶6、 琼脂糖7、 入 DNA8、 pBR322 质粒 DNA二、器材1电泳仪 2电泳槽模板 3紫外灯 4水平仪 5玻璃板(10cmX 16cm)6玻璃纸 7锥形瓶(100mL)【操作步骤】(3)一、 质粒DNA的酶解 一将上一实验纯化的并经真空干燥的自制的pBR322质粒加20吐TE缓冲溶液，使DNA完 全溶解二、 琼脂糖凝胶电泳(1) 琼脂糖凝胶的制备(2) 胶板的制备(以上两步操作已由老师事先制备完成)(3) 加样：取10 uL酶解液与约15 uL的溴酚蓝染色液混匀，用微量移液枪小心加入 样品槽中。

注意上样时要小心操作, 在用微量移液枪吸取混合样品时不要含有气泡，可以放 慢速度，在移液至样品槽中时，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿4) 电泳分离：接通电源，电压为60〜80V,电流为40〜50mA，当溴酚蓝移到距离胶板下 约1〜2cm处时，停止电泳5) 观察：在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板注意事项】注意事项(1) 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应2) 在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应注意防护3) 在用微量移液枪吸取混合样品时不要含有气泡，可以放慢速度4)在移液至样品槽中时，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿 【实验结果】其中，第一、第七组结果可以第5尚可第3组失败，没有提取出DNA第2、第8组提取效率很低第4、6DNA有部分断裂另，因marker的大小是100,200,300,400,500,600bp我们跑电泳时间偏长，marker 条带已经跑出泳道看不见了我们组为第四组，DNA有部分断裂实验分析及讨论】 实验误差分析我们组DNA有部分断裂的原因可能是：存在核酸酶污染或实验操作有问题可 能在实验过程中混有少量的蛋白质，或者在实验的提取过程中加入溶液混合所经 历的时间过长，因为在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组DNA。

在实验中我们也发现纯化的并经真空干燥的自制 的pBR322质粒呈现白色块状(应为无色透明状)如 下图所示，所以有可能已混入杂质讨论1、什么是质粒？答：质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色 体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上现在常用的质粒大多数是经过改造或人 工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具2、 什么是DNA的变性和复性？⑷DNA的变性是指：DNA分子内部的双螺旋结构被破坏，解链为单链，DNA将失去原有的 空间结构，虽然此时不伴有共价键的断裂，但其空间结构的改变，将造成核酸的理化性质与 生物学功能也随之改变，这种现象称为变性DNA的复性是指：DNA的变性是可以可逆的当热变性后，温度缓缓下降，被解开的两条 链又可重新互补结合，恢复成原来完整的DNA双螺旋结构分子这一过程称为复性或退火3、 提取质粒所用的酚：氯仿，异戊醇的比值是多少 提取质粒所用的酚：氯仿，异戊醇的比值是25:24:1在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气 泡会阻止相互间的充分作用加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡 沫产生。

一般采用氯仿与异戊酵为24： 1之比也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25： 24:1， 同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳 定参考文献（1） 摘自仪器仪表之家资料库 百度文库 《生物化学与分子生物学实验技术》 主编：厉朝龙 浙江大学出版社（4） 《生物化学复习纲要和练习》 主编：厉朝龙。