hpv主要竞争产品分析.ppt

HPV 竞品分析品分析市场部市场部 王飞雁王飞雁HPV 检测检测HPV DNA 检测检测HPV E6，，E7 mRNA 检测检测分型分型不分型不分型部分分型部分分型方法方法代表厂家代表厂家PCR-反向点杂交法亚能、凯普、达安、港龙、珠海赛乐奇流式荧光杂交法上海透景杂交捕获（HC2）QIAGEN(凯杰)PCR-荧光探针法港龙、凯普、达安、科华PCR-荧光探针法罗氏bDNA 技术科蒂亚酶切信号放大法（Cervista）HOLOGIC(英硕力) 不分型 PCR-PCR-反向点反向点杂交法原理交法原理 PCR-反向点反向点杂交法技交法技术特点特点n高灵敏度-PCRn高特异性-核酸分子杂交n高通量-膜上固定多种探针n能实现HPV分型检测  亚亚 能能 凯凯 普普技术原理技术原理PCR+反向点杂交PCR+膜杂交法（实质为PCR+反向点杂交）标本本类型型宫颈脱落细胞，疣体组织，病理石蜡切片，液基细胞学标本宫颈脱落细胞检测HPV 种种类23型无HPV 44，低危型21型无HPV73，83，MM4（82）而73、82型为IARC认定的15种常见高危型之一DNA提取提取提取试剂只含裂解液一种成分提取试剂分溶液Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,提取步骤复杂PCRPCR反应液已分装PCR反应液未分装，需人工配制反应液杂交交全自动核酸分子杂交手工杂交结果果判判读显色斑点大，边界清晰判读结果方便快捷膜条小，显色斑点小判读结果时需与对照卡进行比对内部内部质控控有真正意义的内部质控无真正意义的内部质控亚能和凯普亚能和凯普HPV基因分型产品对比基因分型产品对比亚能和能和凯普膜条普膜条显色色对比比亚能亚能凯普凯普膜条尺寸：12mm×78mm膜条尺寸：22mm×22mm亚能能产品与品与凯普普HPV分型分型产品的比品的比较优势n有配套的全自动核酸分子杂交仪n检测HPV 型别多：23型n有真正意义的内部质控n可检测更多类型的标本，有文献支持n灵敏度、特异性、重复性好nPCR扩增体系预分装n显色斑点大而清晰，易于进行结果判读HPV 检测检测HPV DNA 检测检测HPV E6，，E7 mRNA 检测检测分型分型不分型不分型部分分型部分分型方法方法代表厂家代表厂家PCR-反向点杂交法亚能、凯普、达安、港龙、珠海赛乐奇流式荧光杂交法上海透景杂交捕获（HC2）QIAGEN(凯杰)PCR-荧光探针法港龙、凯普、达安、科华PCR-荧光探针法罗氏bDNA 技术科蒂亚酶切信号放大法（Cervista）HOLOGIC(英硕力) 不分型n代表厂家：上海透景n高危型人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒n检测的基因型：19种高危型（ 16,18,31,33,35,39,45, 51,52, 56,58, 59, 68,73,83，26, 55, 61,66 ）， ７种低危型（ 6,11,40,42,44,53,54 ）(无注册证)n进口专用仪器(美国Luminex多功能流式点阵分析仪）流式流式荧光光杂交法交法流式流式荧光光杂交法交法•流式荧光杂交法是将PCR产物和微球杂交液进行混合，并经过杂交，荧光素标记，Luminex流式分析仪阅读得到相应的检测结果。

•微球杂交液中包含多种荧光编码微球，每种编码微球的表面都共价交联有与HPV 型别对应的探针，在杂交过程中，探针特异性识别并结合相应的靶序列，经过荧光素反应后形成微球-探针-PCR产物-荧光素的复合物，经Luminex流式分析仪阅读，可以获得每种复合物的微球编码及对应的荧光信号强弱，得出检测结果流式流式荧光光杂交法操作流程交法操作流程PCR 扩增DNA提取向微孔杂交板中加入微球杂交液，加入PCR产物PCR产物变性杂交，48℃，30 min加入荧光素SA-PE(链霉亲和素标记的藻红蛋白)，15 minLuminex 流式分析仪检测Luminex 100TM多功能流式点阵仪流式流式荧光光杂交法交法-HPV 不定量不定量流式流式荧光光杂交法技交法技术总结•原理：普通PCR技术，核酸分子杂交技术和荧光标记•技术尚不成熟，灵敏度和特异性有待提高•只分型，不定量•需价格昂贵的流式荧光检测仪项目亚　能亚　能透　景透　景技术原理技术原理基因芯片法流式荧光杂交法操作步骤操作步骤DNA提取—PCR—杂交—化学显色—判读结果 DNA提取-PCR－杂交－荧光标记－激光判读 检测通量检测通量检测23种HPV基因型（18种高危型和5种低危型) 检测26种HPV基因型（ 19种高危型和7种低危型，注册证只批检19高危）基本设备基本设备离心机、PCR仪、普通杂交仪离心机、PCR仪、LuminexLuminex多功能流式点阵多功能流式点阵分析仪分析仪标本类型标本类型宫颈脱落细胞、疣体组织、石蜡切片、液基细胞学标本宫颈脱落细胞灵敏度灵敏度高较低特异性特异性高较低理论耗时理论耗时6小时5小时标本保存时标本保存时间间室温下放置时间长（12小时） 室温下放置时间短（1小时） PCR反应液反应液已配制并预分装分成引物混合液，PCR预混液，聚合酶三部分，需人工配制亚能与流式荧光杂交法对比亚能与流式荧光杂交法对比亚能能产品与上海透景品与上海透景产品的比品的比较优势n灵敏度，特异度更高n通用仪器设备n可检测更多来源的标本n标本保存时间更长nPCR 反应液预分装亚能生物能生物港港龙技技术原理原理基因芯片技术基因芯片技术检测HPV型型别18种高危，5种低危16种高危，10种低危主要主要仪器器设备离心机、普通PCR仪、普通杂交仪离心机、普通PCR仪、HPV分型基因芯片检测阅读系统标本本类型型宫颈脱落细胞、液基细胞学标本、疣体组织、石蜡切片标本宫颈脱落细胞灵敏度灵敏度高（1×103拷贝/毫升）低（1×105拷贝/毫升）PCR 扩增增PCR反应液已分装，减少操作人员工作量，避免污染PCR反应液未分装，增加操作人员工作量，带来污染风险杂交方式交方式单管密封杂交，避免污染在96微孔板中杂交，敞开环境，易污染。

结果判果判读可直接用肉眼判读结果，无需专用设备必须用配套的基因芯片检测阅读系统来判读结果亚能生物与港龙亚能生物与港龙HPV 基因分型对比基因分型对比HPV 检测检测HPV DNA 检测检测HPV E6，，E7 mRNA 检测检测分型分型不分型不分型部分分型部分分型方法方法代表厂家代表厂家PCR-反向点杂交法亚能、凯普、达安、港龙、珠海赛乐奇流式荧光杂交法上海透景杂交捕获（HC2）QIAGEN(凯杰)PCR-荧光探针法港龙、凯普、达安、科华PCR-荧光探针法罗氏bDNA 技术科蒂亚酶切信号放大法（Cervista）HOLOGIC(英硕力) 不分型杂交捕交捕获二代（二代（Hybrid Capture 2, HC2））nHC2基本原理：利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测n13种高危HPV基因型,不能提示具体的基因型计算机判读15 min杂交60 min抗体捕获60 min第二抗体结合，化学发光30 minDNA变性45 minHC2 实验步步骤图示示吸取变性剂于对照和样本管中旋涡振荡10秒65℃孵育45分钟，采用Microplate heater I HC2操作步操作步骤-DNA 变性性将已变性的样本混匀，吸取75 ul 于“杂交微孔板”中20-25℃孵育10分钟加入25 ul 高危HPV探针于微孔板中65℃孵育60分钟置于Rotary Shaker I中，1100 rpm，3±2分钟准备HPV 探针混合物HC2操作步操作步骤-杂交交将杂交产物转移至“捕获微孔板”相应的小孔中20-25℃孵育30-45分钟20-25℃孵育60分钟， 1100 rpm加入75 ul Detection Reagent 1（碱性磷酸酶偶联的抗体）于“捕获”微孔板相应的小孔中HC2操作步操作步骤-抗体捕抗体捕获及及酶标洗涤微孔板：采用Automated Plate Washer I或进行手动洗板，重复洗6次加入75 ul Detection Reagent 2 （化学显色底物）于“捕获”微孔板相应的小孔中20-25℃孵育15-30分钟采用Digene microplate luminometer (DML2000)读数HC2操作步操作步骤-洗板及化学洗板及化学显色色HC2如何如何进行行结果判果判读?1.阴性阴性对照照 每次实验必须同时做3份阴性份阴性对照照。

阴性对照的结果必须为10-250 RLU（相对光单位）变异系数（异系数（%CV））应该≤25%，如果＞25%，那么去掉偏离平均值最远的一个阴性对照，用剩下的两个阴性对照计算平均值以及变异系数 %CV必须≤25%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告2.标准品准品 每次实验必须同时做3份高危份高危HPV标准品准品 %CV应该≤15%，如果＞15%，那么去掉偏离平均值最远的一个标准品，用剩下的两个标准品计算平均值以及变异系数 %CV必须≤15%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告3. 用标准品平均值（MHRC）以及阴性对照平均值MNC计算MHRC/ MNC比比值.2.0≤MHRC/ MNC ≤15如果＜2.0 或＞15，本次实验结果无效，必须重做4. 如果符合以上的标准，检测结果是可靠的此时的Cutoff值（阳性标本评判的标准）就是MHRC阴性对照阴性对照 （（NC））高危高危HPV标标准品准品(HRC)9731210133591307平均值平均值96318%CV4.94.7HRC/ NC3.31Cutoff 值=318，所有标本的相对光单位（RLU）应该转换为与Cutoff值的比值，比值大于1为阳性，比值小于1则为阴性结果的判定果的判定质控控对照对照HPV 基因型基因型预期的结果（预期的结果（RLU/Cutoff值）值）最小值最小值最大值最大值QC1-LRHPV 60.0010.999QC2-HRHPV 16283份阴性对照，3份高危HPV标准品，2份质控，共需额外消耗8人份试剂！HC2-定性定性检测以上为以上为FDA 批准的说明书中内容截图批准的说明书中内容截图HC2技技术总结n原理：采用核酸分子杂交，抗体捕获（吸附杂交体），化学显色n不分型n不能检测HPV多重感染n不定量n有交叉杂交反应n手动操作很多，步骤繁琐n每次实验要额外消耗8人份试剂，试剂成本高n需基因杂交信号放大系统，设备成本高项目目基因芯片（基因芯片（亚能）能）HC2技技术原理原理PCR+反向点杂交+化学显色分子杂交＋抗体捕获+化学显色是否分型是否分型分型，确定具体的基因型不能分型，仅提示是否有HPV感染检测检测HPV种类种类检测23种HPV基因型，18种高危，5种低危检测13种高危型标本类型标本类型宫颈脱落细胞、疣体组织、病理石蜡切片，液基细胞学标本宫颈脱落细胞，液基细胞学标本灵敏度灵敏度高（1000 copies/mL）低（100000 copies /mL）交叉杂交交叉杂交无有基基 本本 设 备离心机、普通PCR仪、普通杂交仪（价格低廉）基因杂交信号放大系统（价格昂贵）检测成本检测成本可单人份使用，一次可检测标本量96个或更多每次实验需额外消耗8人份试剂，试剂成本高亚能能HPV产品与品与HC2的比的比较优势n能分型n检测23种HPV 基因型n可检测更多来源的标本n无交叉杂交反应，特异性高n通用仪器设备，如PCR仪和杂交仪n检测成本低 careHPV Test定性检测14种高危型 HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68产品名称产品名称：高危型人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测试剂盒方法方法：杂交捕获-化学发光法商品名商品名： careHPV Test该检测技术专为缺少水、电或现代化实验室等基础设施落后的临床环境设计，便于携带、易于使用，当日可出检查结果careHPV识别宫颈癌与高度病变的敏感度和特异度，都大大优于醋酸染色后观察法HPV 检测检测HPV DNA 检测检测HPV E6，，E7 mRNA 检测检测分型分型不分型不分型部分分型部分分型方法方法代表厂家代表厂家PCR-反向点杂交法亚能、凯普、达安、港龙、珠海赛乐奇流式荧光杂交法上海透景杂交捕获（HC2）QIAGEN(凯杰)PCR-荧光探针法港龙、凯普、达安、科华PCR-荧光探针法罗氏bDNA 技术科蒂亚酶切信号放大法（Cervista）HOLOGIC(英硕力) 不分型PCR-荧光探光探针法法化 学 原 理n原理： 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,实时监控整个PCR过程。

n基于Taqman探针PCR-荧光探光探针法法总结•灵敏度高•不分型，或部分分型•不能检测HPV多重感染•检测HPV 种类有限，目前最多检测14种高危型•自动化程度高•需价格昂贵的荧光定量PCR仪 项 目目亚能生物基因分型能生物基因分型PCR-荧光探光探针法法技技术原理原理PCR+反向点杂交+化学显色PCR+荧光标记+发光、读数理理 论 耗耗 时6小时3小时标本本类型型宫颈脱落细胞、疣体组织、病理石蜡切片，液基细胞学标本宫颈脱落细胞，液基细胞学标本基基 本本 设 备普通PCR仪、普通杂交仪（价格低廉） 荧光定量PCR仪（价格昂贵）检测通量检测通量23型2/8/10/13型等是否分型是否分型分型，确定具体的基因型不分型，仅提示是否有HPV感染多重感染多重感染能检测多重感染检测不能检测多重感染检测亚能与亚能与PCR-荧光探针法对比荧光探针法对比亚能能产品与品与PCR-荧光探光探针法的比法的比较优势n能分型n检测23种HPV 基因型n能检测HPV多重感染n可检测更多来源的标本n使用普通PCR仪n特异性更高亚能生物能生物HPV基因分型与基因分型与罗氏氏对比比亚能生物能生物罗氏氏原理原理PCR-反向点杂交法PCR-荧光探针法仪器器设备离心机、PCR仪、杂交仪。

价格低廉，适合各级实验室使用Combas 4800价格昂贵检测HPV型型别数量数量23种14种能否分型能否分型能仅能区分HPV 16,18型标本本类型型宫颈脱落细胞、疣体组织、石蜡切片宫颈脱落细胞HPV 检测检测HPV DNA 检测检测HPV E6，，E7 mRNA 检测检测分型分型不分型不分型部分分型部分分型方法方法代表厂家代表厂家PCR-反向点杂交法亚能、凯普、达安、港龙、珠海赛乐奇流式荧光杂交法上海透景杂交捕获（HC2）QIAGEN(凯杰)PCR-荧光探针法港龙、凯普、达安、科华PCR-荧光探针法罗氏bDNA 技术科蒂亚酶切信号放大法（Cervista）HOLOGIC(英硕力) 不分型酶切信号放大法切信号放大法n代表厂家：美国Hologic，中国子公司-英硕力n产品名称（中文）：高危型人乳头瘤状病毒DNA 检测试剂盒（酶切信号放大法）n产品名称（英文）：Cervista HPV HR亚能生物能生物 HPV 基因分型基因分型英英硕力力 Cervista 技术原理技术原理PCR-反向点杂交法酶切信号放大法检测检测HPV种类种类18种高危（HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，83），5种低危（HPV6，11，42，43，81）14种高危型（HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68）能否分型能否分型能精确分型不能分型每每批批实实验验标标本数量本数量1-96个，每个样本检测只需1管1-28个，每个样本检测需分3管操作标本类型标本类型宫颈脱落细胞、疣体组织、石蜡切片标本宫颈脱落细胞DNA 提提取取时时间间30分钟/28个标本，操作简便120分钟/28个标本，操作繁琐交叉反应交叉反应无对HPV 67 、HPV 70有交叉反应亚能生物与能生物与Cervista 的比的比较优势n能对HPV进行精确分型n检测HPV 种类多：能检测23种HPVn兼容标本类型多n单次检测标本量多：最多可做96个标本n无交叉反应n标本处理简便快速。