微观繁殖体与绿藻相互作用的研究.docx

微观繁殖体与绿藻相互作用的研究微观繁殖体与绿藻相互作用的研究 2016/04/15 《海洋与湖沼杂志》2015年第六期 摘要 连年暴发的浒苔绿潮灾害对我国近海生态安全造成了严重的危害,因此本实验选取了中国沿海常见赤潮藻种亚历山大藻以及浒苔微观繁殖体中的配子为研究对象,在室内控制条件下模拟了浒苔配子在发育早期两个重要阶段(固着和萌发阶段)与四株亚历山大藻之间的相互影响效应研究发现:浒苔配子在固着阶段对四株亚历山大藻的生长无明显影响,但在随后的萌发阶段却显著抑制了塔玛亚历山大藻的生长,第7天的生长抑制率达到27%而四株亚历山大藻均可强烈抑制浒苔配子的固着,24hID50均小于50cells/mL,但对随后浒苔配子的萌发并无影响因此在两者的相互作用关系中,微藻的竞争优势主要体现在浒苔配子固着阶段,浒苔的竞争优势则体现在配子萌发阶段进一步的研究发现,亚历山大藻对浒苔配子固着的抑制效应是通过分泌某些物质(非PSP毒素)产生的,该类物质可能由蛋白类和非蛋白类成分共同组成而浒苔配子分泌的化感物质造成了其对塔玛亚历山大藻的抑制效应。

关键词 绿潮;浒苔;微观繁殖体;相互作用 大型海洋绿藻大量繁殖或聚集形成的藻华现象为“绿潮(GreenTides)”,是世界沿海各国普遍发生的一种生态现象自2007年以来,我国黄海海域连续8年发生了大规模的绿潮灾害,该绿潮主要原因种为浒苔;中国海洋环境质量公报,2007—2014)浒苔作为一种机会型的大型绿藻,生活史非常复杂,整个生命过程由微观繁殖体阶段和可见的藻丝体阶段交替进行浒苔微观繁殖体作为浒苔生长发育的早期形成产物,主要包括孢子、配子、合子这些无细胞壁保护的裸露单细胞,在适宜的温盐等条件下,微观繁殖体遇到合适附着基就会固着,进而萌发生长成藻丝体,固着和萌发是浒苔生长发育的必要阶段大量的调查数据表明浒苔微观繁殖体不仅是浒苔绿潮形成过程的重要产物,而且作为绿潮发生的“种子库”在整个绿潮的发生发展过程中发挥重要作用亚历山大藻是一种世界沿海分布较广、危害严重的赤潮原因种,由其引发的赤潮规模呈现逐年扩大的态势在我国沿岸的南北海域中,亚历山大藻也广泛分布,是近年来常见的赤潮生物(周名江等,2003) 该藻不但能产生麻痹性贝毒，还产生其它有毒有害物质危害海洋生态环境Jser(1995)指出形成绿潮的大型海藻可通过与其它浮游植物的相互作用而影响绿潮发生海域的种类分布与生态格局;秦玉涛等(2011)发现浒苔绿潮暴发期间南黄海海域浮游植物种类、细胞数、多样性均发生一定变化。

Sfriso等(1994)发现绿潮暴发的水域赤潮却很少暴发;夏斌等(2009)在非浒苔区发现有小面积的裸甲藻赤潮,临近的浒苔暴发海域内却未发现赤潮上述研究均反映了自然水体中绿潮对浮游植物的影响效应,甚至可以影响赤潮的发生绿潮暴发后对海域中浮游植物的影响是通过多种途径进行的,其中部分研究结果表明大型绿藻的藻体会通过分泌化感物质来影响微藻生长(霍元子等,2010;Wangetal,2013)浒苔微观繁殖体作为其生长发育过程的早期形成产物,细胞结构较为简单,对微藻的影响效应的开端和发展、对黄海绿潮的贡献,以及微藻对于浒苔微观繁殖体的反向作用,目前关于这类两者间的相互影响效应还未见报道本文针对以上问题,选取了浒苔微观繁殖体中极具代表力的配子以及上述常见有害赤潮藻种亚历山大藻,通过营养盐充足条件下的浒苔配子与赤潮藻的共培养实验,在实验室模拟了浒苔微观繁殖体早期2个重要阶段(固着和萌发阶段)与亚历山大藻间的影响作用,以期为绿潮和赤潮相关研究提供参考 1材料与方法 1.1微藻与浒苔的培养实验所用微藻全部取自中国科学院海洋研究所海洋生态实验室塔玛亚历山大藻ATHK藻株分离自南海香港海域,链状亚历山大藻(A.catenella)ACDH藻株分离自东海长江口海域,这两株藻均由暨南大学提供;微小亚历山大藻AM-LYG藻株分离自黄海连云港海域;以上三种亚历山大藻均可以产生PSP毒素。

不产PSP毒素的相关亚历山大藻(A.affine)CH分离自黄海,由国家海洋局第三海洋研究所提供将微藻分别在f/2-Si培养液(Guillard,1975)中培养至指数生长期待用,培养温度为20C,光照4000lx,光暗比为14∶10实验海水为管道海水(取自青岛太平角),经沙滤、沉淀,0.45μm混合纤维滤膜过滤,再用高温煮沸灭菌浒苔采集于青岛汇泉湾将采集的鲜活浒苔去除泥沙,用混合抗生素进行灭菌处理,再用灭菌海水漂洗3—4次,镜检确认无杂藻后,无菌培养于f/2-Si培养液中,同时添加1mg/LGeO2以消除硅藻的影响培养条件、所用海水均同微藻 1.2浒苔配子的获得采集到浒苔的繁殖方式为单性生殖(Liuetal,2015)浒苔配子体产生的配子未经融合形成合子,而是直接发育成配子体,继续释放配子完成单性循环浒苔配子主要是通过形态学观察及趋光性检测来判断:形态学观察到配子个体大小约为6μm3μm,呈长椭圆形,前端透明,后端为绿色的色素体,细胞内一般含有一个橘红色的眼点和一个蛋白核,顶生两根鞭毛使其可以快速运动;在趋光性检测中呈现明显的正趋光利用断裂的方法诱导浒苔释放配子(Danetal,2002)。

将单株浒苔配子体切为1—2cm长的片段,放入盛有f/2-Si培养液的培养皿中,每天更换新鲜培养液,诱导配子囊的形成2—3天后,待藻体颜色由浅绿色变为黄褐色,在光下刺激浒苔释放配子,待其释放完毕变为白色后,取出藻段,将配子液收集,迅速进行实验 1.3浒苔配子固着阶段与亚历山大藻的相互影响效应 1.3.1亚历山大藻对浒苔配子固着的影响实验采用共培养的方法进行,将刚释放的浒苔配子接种到50mL小烧杯中,其中对照组为浒苔配子单培养组(培养介质为无菌海水),实验组分别加入四株不同的亚历山大藻藻株,为浒苔配子与亚历山大藻共培养组,浒苔配子的终密度设为2.0104cells/mL,微藻密度分别设为0.01104cells/mL和0.1104cells/mL,反应体系为40mL每个小烧杯底部放置1个盖玻片,便于固着配子的计数全部对照组和实验组避光培养1天,以保证浒苔配子的随机固着1天后取出盖玻片,在灭菌海水中轻微震荡数次,洗去未附着的配子光学显微镜下随机观察20个视野(4010倍),取其平均值计算固着的配子量,以此固着量作为统计指标实验开始前加入f/2培养液,保证整个实验过程中不受营养盐的限制每组实验设置3个平行组。

1.3.2浒苔配子固着对亚历山大藻生长的影响实验同样采用共培养的方法进行,培养条件同1.3.1但是对照组为四株亚历山大藻单培养组,实验组依旧为浒苔配子与亚历山大藻共培养组统计指标为亚历山大藻的藻细胞密度实验结束后从每个烧杯中各取1mL藻液,用碘液固定,计数板计数,每个样品计数3次,取其平均值每个处理包含3个平行组 1.4浒苔配子萌发阶段与微藻的相互影响效应 1.4.1亚历山大藻对浒苔配子萌发的影响实验开始前1天,将浒苔配子接种到40mL含f/2培养液的50mL小烧杯中,接种密度为2.0104cells/mL,避光培养以保证浒苔配子的随机固着实验开始时恢复光照培养,并分别加入四株不同的亚历山大藻藻株,对照组为浒苔配子单培养组,实验组为浒苔配子与亚历山大藻共培养组,微藻密度设置为0.1104cells/mL烧杯底部放置1个盖玻片便于观察配子萌发,实验持续7天每天用显微镜计数盖玻片上配子的萌发率(以分裂为两细胞为萌发标准),每个盖玻片计数20个视野萌发率(%)=N/N0100%(N0,一个视野中总的配子数;N,一个视野中萌发的配子数)每次取样结束后,向实验体系中补充200μLf/2营养液,以保证实验过程中不受营养盐限制。

每组实验设置3个平行组 1.4.2浒苔配子萌发阶段对亚历山大藻的影响整个实验培养条件同1.4.1但是对照组设定为4株不同的亚历山大藻单培养组,实验组为浒苔配子与亚历山大藻共培养组,以亚历山大藻细胞密度作为统计指标实验开始前1天,将浒苔配子接种到40mL含f/2培养液的50mL小烧杯中,接种密度为2.0104cells/mL,避光培养以保证浒苔配子的随机固着实验开始时恢复光照培养,持续7天每天取出200μL藻液,用碘液固定,计数板计数,每个样品计数3次,取其平均值,计算微藻细胞密度微藻生长抑制率I=(1–N1/N2)100%(N1为共培养组藻细胞密度;N2为单培养组藻细胞密度) 1.5亚历山大藻对浒苔配子固着的可能影响效应研究 1.5.1相关亚历山大藻(CH)不同组分对浒苔配子固着的影响效应将处于指数生长期的相关亚历山大藻液用10μm筛绢过滤,得到藻细胞过滤液和藻细胞,将得到的藻细胞重新悬浮于灭菌的海水中,得到藻细胞重悬液利用超声波细胞破碎仪将藻细胞破碎后,离心15min,取上清液得到藻细胞内容物,收集到的沉淀则为藻细胞碎片将上述组分以灭菌海水稀释到相当于藻细胞密度为50cells/mL后用于实验。

实验方法同1.3.1 1.5.2相关亚历山大藻(CH)去藻过滤液组分对浒苔配子固着的影响效应(1)温度和pH对相关亚历山大藻(CH)去藻过滤液毒性的影响用10μm筛绢过滤相关亚历山大藻,得到去藻过滤液,分别置于温度为60、80、100C的水浴中处理30min,然后取出恢复到室温20C,进行对浒苔配子固着的影响实验,培养条件及实验方法同1.3.1将得到的去藻过滤液,分别用HCl和NaOH将其pH调为2.1、6.1、12.1,30min后再调回到起始的pH8.1,进行对浒苔配子固着的影响实验,培养条件及实验方法同1.3.12)去蛋白组分对相关亚历山大藻(CH)去藻过滤液毒性的影响将得到的相关亚历山大藻去藻过滤液,加热蒸发去除蛋白组分然后进行对浒苔配子固着的影响实验,培养条件及实验方法同1.3.1 1.6浒苔配子萌发阶段对塔玛亚历山大藻生长的可能影响效应研究实验采用共培养的方法进行,实验方法同1.4.2对照组为塔玛亚历山大藻(ATHK)单培养组,实验组分别为浒苔配子、浒苔配子培养过滤液与塔玛亚历山大藻共培养组将密度为2104cells/mL的浒苔配子在含f/2培养液的小烧杯中培养,培养液经灭菌的0.45μm混合纤维滤膜过滤,得到培养过滤液。

立即接种处于对数生长期的塔玛亚历山大藻,初始密度设置为0.1104cells/mL每隔1天将小烧杯中的培养液移出4mL,然后添加4mL新鲜浒苔培养滤液以保持培养液体积的恒定对照组添加4mL灭菌海水,实验时间7天,计算微藻生长抑制率 1.7数据处理实验数据采用Excel2007作图,SPSS16.0统计软件进行样本检验分析,所得数据均以平均值标准误表示(n=3)并进行单因素方差分析(ANOVA),用Duncan进行多重比较检验和差异显著性分析,P 2结果 2.1亚历山大藻对浒苔配子固着与萌发的影响 2.1.1亚历山大藻对浒苔配子固着的影响四株亚历山大藻藻株对浒苔配子的固着均有强烈的抑制效应,并且随着浓度的升高,其抑制效应逐渐加强(图1)其中四株亚历山大藻在生物量为0.01104cells/mL时(野外赤潮密度),对浒苔配子的固着就存在着显著的影响,最大固着量仅达到7cells/mm2,显著低于对照组(P 2.1.2亚历山大藻对浒苔配子萌发的影响图3显示了四株亚历山大藻对浒苔配子萌发率的影响尽管四种亚历山大藻在3—5天。