包埋法固定化微生物问题初探.docx

包埋法固定化微生物问题初探韩斌 (南开大学环境科学与工程学院 环境科学系)指导老师：李莹 蔡宝立 潘继伦摘 要 本文概括介绍并比拟了固定化技术的几种主要的方法，并对目前笔者正在进行的包埋法固定化试验中的两个方法——海藻酸钠包埋法和PVA—H3BO3包埋法做了一定的介绍和不同方法的比拟最后，简要介绍了固定化细胞的性能的评价以及该种技术的应用和前景关键字 固定化 包埋法 海藻酸钠 PVA—H3BO3 载体1、 引言固定化微生物技术使用化学或物理手段，将游离细胞或者酶定位于限定的区域，使其保持活性并可反复利用的方法最初主要用于发酵生产，70年代后期，被利用到水处理领域，近年来那么成为各国学者研究的热点固定化微生物技术克服了生物细胞太小，与水溶液别离较难，易造成二次污染的缺点，保持了效率高、稳定性强、能纯化和保持高效菌种的优点，在废水处理领域有广阔的应用前景在实际应用过程中，如何固定、何种载体，才能使固定化微生物能较长时间的保持一定的强度和活度，才能降低固定化本钱，延长固定微生物的使用寿命，是该技术在污水处理中得到广泛应用的关键2、 常用的固定化方法废水处理中常用微生物固定化方法主要有：包埋法、交联法、载体结合法。

2.1包埋法包埋法的原理是将微生物细胞截流在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中通过聚合作用或者离子网络形成，或通过沉淀作用，或改变溶剂、温度、pH值使细胞截流凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄漏，同时能让基质渗入和产物扩散出来固定化微生物细胞的实用化对包埋载体的要求包括：（1） 固定化过程简单，易于制成各种形状，能在常温常压下固定化；（2） 本钱低；（3） 固定化过程中及固定化后对微生物无害；（4） 基质通透性好；（5） 固定化细胞密度大；（6） 载体内细胞漏出少，外面的细胞难以进入；（7） 物理强度和化学稳定性好；（8） 抗微生物分解；（9） 沉降别离性好 在这些要求中，〔1〕和〔2〕涉及固定化细胞制备的本钱；〔3〕~〔6〕针对固定化细胞的催化活性；而〔7〕~〔9〕那么是出于对固定化细胞的操作稳定性的考虑2.2交联法交联法是使用双功能的试剂与酶分子进行分子间的交联固定化方法由于酶蛋白的功能团参与此反响，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶显著失活此外，交联剂如戊二醛等价格昂贵，限制了其应用2.3吸附法又称载体结合法，是通过物理吸附、化学或者离子的结合，将微生物固定于非水溶性载体。

这种方法操作简单，对微生物活力影响小，但所结合的微生物数量有限，反响稳定性和反复使用性差主要分为物理吸附法、共价结合法、离子结合法和生物特异性吸附法四种方法2.4三种固定化方法的比拟尽管固定化方法多种多样，但没有一种理想的、普遍适用的方法交联法突出优点是可以获得很高的细胞密度，但由于缺乏良好的机械强度而不能得到广泛的应用吸附法的固定操作简单，条件温和，而且载体可以再生；但是细胞与载体之间的结合力较弱，因此操作的稳定性不好包埋法有较好的综合性能，催化活性保存和存活力都比拟高，且包埋在反响工程〔包括反响器的设计、操作稳定性等〕中应用灵活，因此，包埋法成为整个固定化生物催化剂技术中应用最广泛的固定化方法；但是包埋法的扩散阻力较大，使细胞的催化活性受到限制，且不适用于涉及大分子物质的反响三种固定化方法总结于下表：表一 三种固定化方法的比拟性 能交联法吸附法包埋法制备的难易结合力活性外表固定化本钱存活力适用性稳定性载体的再生空间位阻适中强低适中无小高不能较大易弱高低由适中低能小适中适中适中低有大高不能大3、 包埋法固定化微生物的两种方法举例天然高分子多糖类的海藻酸钠，具有固定化成形方便，对微生物毒性小以及固定化密度高等优点，但是其抗微生物分解性能较差，机械强度较低，同时海藻酸钠凝胶再高浓度的磷酸缓冲液的反复冲击下，经过一段时间，颗粒变软、粘连。

合成高分子化合物中常用的载体材料是聚乙烯醇〔polyvinyl alcohol 简称PVA〕，其突出优点是抗微生物分解性能好，机械强度高，化学稳定性能好但是聚合物网络的形成条件比拟剧烈，对微生物细胞的损害较大，而且成形的多样性和可控性不好下面将对这两种包埋方法作一个简单的介绍：3.1海藻酸钙包埋法3.1.1原理 海藻酸钙包埋法是一种使用最广、研究最多的包埋固定化方法，它具有固化、成形方便，对微生物毒性小，固定化细胞密度高等优点海藻酸是用于包埋固定化微生物的第一个聚合物，但是当存在高浓度的K+、Mg2+、磷酸盐以及其他单价金属离子时，海藻酸钙凝交的结构会受到破坏此外，由于海藻酸钙凝胶网络的孔隙尺寸太大，酶可能会从网络中泄露出来，因此不适合大多数酶的固定化海藻酸盐是棕色藻类的胞内产物，它由两种不同类型的单糖组成，即1，4—β—D—甘露糖醛酸〔M〕和1，4—α—L—古洛糖醛酸〔G〕海藻酸盐是一种聚合物海藻酸盐不能形成热可逆性凝胶通常是在其钠盐溶液中参加二价离子，如Ca2+，通过Ca2+取代Na+来形成凝胶网络凝胶的性质与引入的二价阳离子及海藻酸钠的类型〔主要是两种单糖的组成比例〕有关二价阳离子对凝胶的机械强度有较大的影响，元素周期表的第二主族金属离子于海藻酸钠盐形成的凝胶，其强度顺序如下：Ba2+>Sr2+>Ca2+>>Mg2+利用海藻酸钠凝胶固定化微生物法平安、快速、制备简单，反响条件温和，本钱低廉且适用于大多数微生物的固定化。

3.1.2固定化方法以海藻酸盐为载体，建立包埋固定化微生物的方法如下：方法I①将海藻酸钠加热溶于水；②将海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀，使海藻酸钠最终浓度为2%~4%；③将海藻酸钠与菌体混合液用针形管滴入5%~10%的CaCl2溶液中，固定化7~8h；④滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用方法 II①将按方法I制得的固定化细胞颗粒置于0.06mol/L的己二胺溶液中搅拌1~2h；②滤出颗粒，水洗后，用0.5%戊二醛交联5min；③滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用方法III①将按方法I制备的固定化颗粒浸泡于以下溶液中： 壳聚糖 0.5% CaCl2 0.2mol/L pH 6.0②滤出颗粒，水洗后，用0.5%戊二醛交联5min；③滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用 分别利用以上三种固定化方法，包埋黑曲酶细胞，比拟各种固定化细胞的活性，其结果如表二： 表二 海藻酸钙包埋法的比拟固定化方法方法I方法II方法III固定化细胞相对活性57.1%52.9%44.8%由表二可以看出，用海藻酸钠系列包埋固定化方法固定化微生物，固定化细胞的活性较高其中用方法I固定化细胞的活性最高，在方法II、III中，由于在海藻酸钙凝胶表层突上了一层高分子膜，虽然增强了固定化颗粒的机械强度，但是同时加大了底物及氧的扩散阻力，从而降低了细胞活性。

此外，在方法II、III中所采用的戊二醛对细胞液具有毒性，在使用前应作毒性试验，确定是否采用改种交联剂3.1.3海藻酸钠包埋法固定化试剂对细胞活性的影响〔1〕海藻酸钠对细胞活性的影响 海藻酸钠是一类天然高分子多糖类，对微生物没有毒害作用但海藻酸钠的浓度会影响固定化细胞的机械强度、质量传递等，进而影响到微生物的活性海藻酸钠浓度对固定化细胞活性的影响如表三所示表三 海藻酸钠浓度对细胞活性的影响海藻酸钠浓度/%细胞相对活性/%成球难易海藻酸钠浓度/%细胞相对活性/%成球难易1.056.2易2.552.3易1.557.1易3.045.6较难2.055.4易〔2〕CaCl2浓度细胞活性的影响在海藻酸钠包埋固定化过程中，凝胶化剂CaCl2中的Ca2+于海藻酸钠根离子螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶，从而将细胞固定CaCl2溶液的浓度对固定化细胞颗粒机械强度的影响见表四表四 CaCl2浓度对固定化细胞凝胶机械强度的影响CaCl2浓度/%234510机械强度较好较好较好好好随着CaCl2浓度的增加，微生物细胞的活性降低当CaCl2浓度低于5%时，细胞活性可以保持在80%以上；但是当CaCl2浓度到达10%，细胞活性下降到60%左右，主要原因估计有两种〔i〕由于盐的渗析作用，引起细胞脱水，致使微生物活性局部丧失；〔ii〕在PCR技术中，CaCl2是使细胞处于感受态的物质，这个时候微生物是最脆弱的，很容易被外界的干扰破坏。

从表四可以看出，CaCl2浓度对固定化细胞的机械强度影响较大当CaCl2浓度为2%~3%时，固定化颗粒在使用过程中会出现膨胀，甚至出现裂缝活破碎现象因此，海藻酸钙包埋法固定化细胞活性较高3.2 PVA—H3BO3包埋法3.2.1原理聚乙烯醇是一种新型的微生物包埋固定化载体，它具有机械强度高，化学稳定性好，康微生物分解性能强，对微生物无毒，价格低廉等一系列优点，是一种具有实用潜力的包埋材料，近年来在国内外获得了较广泛的研究聚乙烯醇〔polyvinyl alcohol，简称PVA〕的结构为： 聚乙烯醇在加热后溶于水，在其水溶液中参加添加剂后发生凝胶化，或者在低温下〔-10℃〕冷冻形成凝胶，从而将微生物包埋固定在凝胶网络里常用添加剂有硼酸和硼砂，在PVA水溶液中参加硼酸活着硼砂，由于化学反响而形成凝胶PVA于硼酸反响形成的凝胶为单二醇型，与硼砂反响形成的凝胶为双二醇型，其结构式如图1 图1 PVA与硼酸和硼砂形成的凝胶结构PVA于硼砂反响形成凝胶时，成形困难，凝胶呈海绵状结构，强度较低但硼砂的用量较硼酸用量低得多，所以值的进一步研究就目前的研究来看，大多采用H3BO3做交联剂。

PVA—H3BO3包埋法是一种制备容易且价格低廉的固定化方法，其反响原理如图2图2 PVA—H3BO3包埋法的反响原理利用该方法制得的凝胶颗粒机械强度高，使用寿命长且弹性好 3.2.2固定化方法 以PVA为固定化载体，建立了利用PVA—H3BO3包埋固定化微生物细胞的方法，具体方法如下： 方法I①将聚乙烯醇〔PVA〕加热溶于水；②将微生物细胞与PVA溶液混合均匀，使PVA最终浓度为10%；③将上述混合液滴入饱和的硼酸溶液中，放置10h，使其充分反响；④滤出固定化颗粒，用生理盐水洗净，备用方法II①将聚乙烯醇〔PVA〕加热溶于水,冷却；②将微生物细胞与PVA溶液混合均匀，使PVA最终浓度为10%；③将PVA与微生物细胞的混合液到入已灭菌的培养皿中，缓慢参加饱和硼酸溶液，浸泡10h；④将凝胶切成3mm×3mm×3mm的小方块，用生理盐水洗净，备用方法III①将聚乙烯醇〔PVA〕与海藻酸钠加热溶于水,冷却；②将微生物细胞与上述溶液混合均匀，使PVA与海藻酸钠最终浓度分别为7.5％～10%，0.4%～1.0%；③将上述混合液用针形管滴入以下溶液中： H3BO3〔饱和溶液〕 CaCl2 1.0％～5.0％ pH值4.0～7.0④放置10h，使之充分反响；⑤滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。

利用上述固定化方法，包埋固定化黑曲酶，比拟了固定化细胞的活性，结果如表五所示表五 PVA—H3BO3法固定化的比拟固定。