第五章酶4介绍.ppt

(七）、抑制剂对酶作用的影响七）、抑制剂对酶作用的影响1 基本概念基本概念 ⊙ ⊙2 抑制作用的类型抑制作用的类型 ⊙ ⊙3 可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别4 可逆抑制作用动力学可逆抑制作用动力学5 一些重要的抑制剂一些重要的抑制剂Back1 基本概念失活（失活（Inactivation））抑制（抑制（Inhibition））使酶蛋白变性而引起酶活力的丧失使酶蛋白变性而引起酶活力的丧失 酶酶的的必必需需基基团团化化学学性性质质发发生生改改变变，，但但酶酶没没有有变变性性，，而而导导致致的的酶酶活活性的降低甚至丧失性的降低甚至丧失变性剂变性剂抑制剂抑制剂选择性选择性无无有有抑制程度的表示方法：抑制程度的表示方法：不加抑制剂时的反应速率为不加抑制剂时的反应速率为v0，加抑制剂后的速率为，加抑制剂后的速率为vi相对（残余）活力分数相对（残余）活力分数（（a））a = vi / v0抑制分数抑制分数（（i））指被抑制而失去活力的分数指被抑制而失去活力的分数i = 1 - a = 1 - vi / v0Back2 2 抑制作用的类型抑制作用的类型酶酶的的抑抑制制作作用用不可逆不可逆抑制作用抑制作用可逆可逆抑制作用抑制作用irreversiblereversible竞争性抑制竞争性抑制 ⊙ ⊙非竞争性抑制非竞争性抑制 ⊙ ⊙反竞争性抑制反竞争性抑制 ⊙ ⊙competitivenon-competitiveun-competitiveBack非专一性非专一性 ⊙ ⊙专一性专一性 ⊙ ⊙比较比较 ⊙ ⊙可逆与不可逆抑制 抑制剂与酶以抑制剂与酶以非共价键非共价键结合而引起酶活力降低或丧结合而引起酶活力降低或丧失，能用失，能用物理方法物理方法如透析、超滤等除去抑制剂而使酶复如透析、超滤等除去抑制剂而使酶复活，活，抑制作用是可逆的抑制作用是可逆的。

抑制剂与酶的必需基团以抑制剂与酶的必需基团以共价键共价键结合而引起酶活力结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，复活，抑制作用不可逆抑制作用不可逆Back 抑抑制制剂剂作作用用于于酶酶分分子子中中的的一一类类或或几几类类基基团团，，这这些些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活基团中包含了必需基团，因而引起酶失活非专一性不可逆抑制剂抑制剂类型抑制剂类型被抑制基团被抑制基团酰化剂酰化剂烷化剂烷化剂还原剂还原剂和和氧化剂氧化剂有机汞、有机磷有机汞、有机磷Back 这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失专一性不可逆抑制剂酶酶EnzymeSer O有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂XPOO RO RHBack竞争性抑制作用ESESEPk1k2++k3+IEI酶酶酶酶酶酶底物底物抑制剂抑制剂相同的结合位点相同的结合位点机制机制动力学特征动力学特征 ⊙ ⊙实例实例 ⊙ ⊙Backkiki = [E][I] / [EI] 竞争性抑制的动力学特征v[S]无无 I有有 IVmaxVmax2KmKm’1/v1/[S]有有 I无无 Iv = ———————V [S]Km(1+[I ]/ki)+[S][I] 增加增加Back竞争性抑制实例磺胺药物的药用机理磺胺药物的药用机理H2N- -SO2NH2对氨基苯磺酰胺（磺胺）对氨基苯磺酰胺（磺胺）H2N- -COOH 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸谷氨酸谷氨酸蝶呤蝶呤叶酸叶酸叶酸叶酸嘌呤核苷酸的生物合成嘌呤核苷酸的生物合成细细菌菌正正常常生生长长人怎么办？人怎么办？吃！吃！Back非竞争性抑制ESESEPk1k2++k3+IEIkiki = [ES][I] / [ESI] +S+IESIki = [EI][S] / [ESI] 酶酶酶酶酶酶机制机制动力学特征动力学特征 ⊙ ⊙Backv[S]无无 I有有 IVmaxVmax2Vmax’Vmax’2KmKm’=1/v1/[S]有有 I无无 I[I] 增加增加非竞争性抑制的动力学特征Back反竞争性抑制ESESEPk1k2++k3+IESIki = [ES][I] / [ESI] ki动力学特征动力学特征 ⊙ ⊙Backv[S]无无 I有有 IVmaxVmax2Vmax’Vmax’2KmKm’1/v1/[S]有有 I无无 I[I] 增加增加Back反竞争性抑制的动力学特征类型类型无抑制剂无抑制剂竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制方程式方程式VmaxKmVmax不变不变减小减小减小减小Km减小减小不变不变增加增加各类可逆抑制的米氏方程及常数Back别构激活剂别构激活剂别构抑制剂别构抑制剂( (八）酶的别构效应八）酶的别构效应• •别构别构别构别构——蛋白质在实现生物功能时构象发生变化，蛋白质在实现生物功能时构象发生变化，活力改变的现象。

活力改变的现象• •别构酶别构酶别构酶别构酶——具有别构现象的酶具有别构现象的酶w w特点：特点：特点：特点：w w1. 1.多亚基多亚基多亚基多亚基w w一部分亚基有活性中心，一部分亚基有活性中心，一部分亚基有活性中心，一部分亚基有活性中心，w w另一部分有另一部分有另一部分有另一部分有别构调解中心别构调解中心别构调解中心别构调解中心V= V[S]Km + [S]当V=90％％V0.9Km=0.1[S]［S］＝9Km当V=10％％V［S］＝1/9Km[s]10%V[s]90%V= 812.2.2.2.底物也是调节物，不服从米氏方程底物也是调节物，不服从米氏方程底物也是调节物，不服从米氏方程底物也是调节物，不服从米氏方程•S S曲线：正曲线：正曲线：正曲线：正协同＜协同＜81(开关开关)—V↑随［随［S］］↑而而加加快快2 2米氏曲线米氏曲线1 1负协同负协同3 3正协同正协同321V10%V90%V0 [S]V a a a a 仅底物是别构调节物时仅底物是别构调节物时仅底物是别构调节物时仅底物是别构调节物时w w 双曲线：双曲线：双曲线：双曲线：负负负负协同＞协同＞81—V↑随［随［S］］↑而而减慢减慢底物是别构抑制剂底物是别构抑制剂底物是别构激活剂底物是别构激活剂p别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase八、酶活力测定八、酶活力测定 检检测测酶酶的的含含量量及及存存在在，，很很难难直直接接用用酶酶的的“量量”（质量、体积、浓度）来表示。

质量、体积、浓度）来表示 常常用用酶酶催催化化某某一一特特定定反反应应的的能能力力来来表表示示酶酶量量，，即用即用 酶的活力酶的活力 表示Back酶（活力）单位：酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量产物所需的酶量1961年年，，国国际际生生化化协协会会：：在在最最适适的的反反应应条条件件（（30℃））下下，，每每分分钟钟内内催催化化一一微微摩摩尔尔底底物物转转化化为为产产物物的的酶酶量量定定为为一一个个酶酶活活力力国国际际单单位位（（U）），，即：即：1 U = 1μmol/min1972年年，，国国际际酶酶学学委委员员会会：：在在最最适适条条件件下下，，每每秒秒钟钟内内使使一一摩摩尔尔底底物物转转化为产物所需的酶量定为化为产物所需的酶量定为1kat单位（单位（katal），），即：即：1 kat =1 mol/s1 kat = 6×107 U酶活力的表示方法Back酶的比活力酶的比活力定义：定义：每毫克蛋白质中所含有的酶活力单位数每毫克蛋白质中所含有的酶活力单位数（国际酶委）国际酶委）。

酶纯度的代表酶纯度的代表对于同一种酶，对于同一种酶，比活力越高，酶的纯度越高比活力越高，酶的纯度越高碳酸酐酶制品：碳酸酐酶制品：1000 U/mg脲酶制品：脲酶制品：500 U/mg每毫克制品中含有每毫克制品中含有 100微克微克 碳酸酐酶碳酸酐酶每毫克制品中含有每毫克制品中含有 200微克微克 脲酶脲酶脲酶制品：脲酶制品：1000 U/mg每毫克制品中含有每毫克制品中含有 400微克微克 脲酶脲酶Appl.终终点点法法：：酶酶反反应应进进行行到到一一定定时时间间后后终终止止其其反反应应，，再再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化酶活力测定方法酶活力测定方法动动力力学学法法：：连连续续测测定定反反应应过过程程中中产产（（底底））物物或或辅辅酶酶的变化量，直接测定出酶反应的的变化量，直接测定出酶反应的初速度初速度[A]的减少的减少与与[B]的增加的增加均可以用来表明反应的进程均可以用来表明反应的进程A B对于反应对于反应Back反应时间（反应时间（t））产产物物生生成成量量浓度（浓度（[P]））斜率斜率 = 浓度浓度/时间时间 = 反应反应初初速度速度酶促反应的初速度反应进程曲线反应进程曲线Back酶酶 ＋＋ 底物底物T0T1T2T3T4间接方法测定：间接方法测定：电泳、层析、修饰后分析，etc。

请注意请注意：极端条件终止反应极端条件终止反应 First !极端极端pH，极端温度，极端温度酶活力测定的终点法酶活力测定的终点法时程反应时程反应（（Time-course reaction））Back九、酶的制备九、酶的制备1、酶粗提液的制备、酶粗提液的制备 ⊙ ⊙2、酶的纯化、酶的纯化 ⊙ ⊙3、酶制剂的保存、酶制剂的保存 ⊙ ⊙Back酶粗提液的制备（（1）选材）选材 选选择择酶酶含含量量丰丰富富的的新新鲜鲜生生物物材材料料，，一一种种酶酶含含量量丰丰富富的的器器官官或或组组织织往往往往和含量较低的器官或组织相差上千倍或上万倍和含量较低的器官或组织相差上千倍或上万倍 目前常用目前常用微生物微生物为材料制备各种酶制剂为材料制备各种酶制剂2）破碎）破碎 动动物物细细胞胞较较易易破破碎碎，，通通过过一一般般的的研研磨磨器器、、匀匀浆浆器器、、高高速速组组织织捣捣碎碎机机就就可以达到目的可以达到目的 微微生生物物或或植植物物细细胞胞壁壁较较厚厚，，需需要要用用超超声声波波、、细细菌菌磨磨、、冻冻融融、、溶溶菌菌酶酶或或其其他化学溶剂加以处理。

他化学溶剂加以处理3）抽提）抽提 在低温下，以水或低盐缓冲液，从组织匀浆中抽提得到酶的粗提液在低温下，以水或低盐缓冲液，从组织匀浆中抽提得到酶的粗提液Back酶的纯化（（1）注意事项）注意事项 温度、氧化还原条件、重金属离子（螯合剂）、蛋白酶抑制剂温度、氧化还原条件、重金属离子（螯合剂）、蛋白酶抑制剂（（2）纯化指标）纯化指标比活力比活力 ＝＝活力单位数活力单位数mg 蛋白（氮）蛋白（氮）＝＝总活力单位数总活力单位数总蛋白（氮）总蛋白（氮） mg 每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力 纯化倍数纯化倍数＝＝每次总活力每次总活力第一次总活力第一次总活力 回收率（产率）回收率（产率） ＝＝100%×总活力总活力 = 总体积（总体积（ml））×活力单位数活力单位数ml 酶液酶液（（3）纯化手段）纯化手段 ⊙ ⊙Back专一性作用专一性作用底物、抑制剂、辅因子底物、抑制剂、辅因子溶解度溶解度盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、选择性沉淀盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、选择性沉淀分子大小分子大小凝胶过滤、超离心凝胶过滤、超离心吸附能力吸附能力吸附分离吸附分离带电性质带电性质离子交换层析、电泳分离、等电聚焦层析离子交换层析、电泳分离、等电聚焦层析稳定性稳定性选择性变性选择性变性亲和层析亲和层析酶的纯化方法一览表性质性质手段手段Back酶制剂的保存1、低温（、低温（0~4℃，，-20℃））2、提高保存浓度、提高保存浓度3、加入稳定剂、加入稳定剂4、冷冻干燥、冷冻干燥Back一、化学酶工程一、化学酶工程 天然酶、天然酶、固定化酶固定化酶、、化学修饰与人工模拟酶化学修饰与人工模拟酶二、二、生物酶工程生物酶工程 克隆酶、突变酶、新酶克隆酶、突变酶、新酶 将酶学和工程学相结合，产生了将酶学和工程学相结合，产生了酶工程（酶工程（enzyme engineering））这样这样一个新的领域。

酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结一个新的领域酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用十、酶的应用十、酶的应用Back 酶的固定化就是把水溶性酶经酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）物理（吸附法与包埋法）或或化学方法（共价偶联法与交联法）化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态吸附法吸附法：：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上包埋法包埋法：：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中偶联法偶联法：：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上交联法交联法：：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状网状”结构酶的固定化next包埋法包埋法 吸附法吸附法共价偶联法共价偶联法 ⊙ ⊙交联法交联法 ⊙ ⊙固定化酶Back酶的改造酶的改造（化学修饰）（化学修饰）：功能基团的化学修饰酶功能基团的化学修饰酶 酶蛋白侧链的化学修饰酶蛋白侧链的化学修饰 酶分子内或分子间的交联反应酶分子内或分子间的交联反应酶酶的的模模拟拟：：根根据据酶酶作作用用的的原原理理，，摸摸拟拟酶酶的的活活性性中中心心和和催催化化机机理理，，用用化化学学方方法法制制备备结结构构较较简简单单、、高高效效、、高高选选择择性性、、稳稳定定性性能能好好的的新新型型催催化化剂剂，，既既可可以以是是无无机机化化合合物物，，又又可可以以是是有有机机化化合合物物或或小小肽肽。

酶的改造和模拟Back将催化侧链连接到环糊精上，将催化侧链连接到环糊精上，可成功模拟胰凝乳蛋白酶可成功模拟胰凝乳蛋白酶环糊精分子结构环糊精分子结构人工模拟酶 -benzyme底物底物羟基羟基咪唑基咪唑基羧基羧基活性与天然酶相当，稳定性显著提高活性与天然酶相当，稳定性显著提高Back酶的蛋白质结构功能酶的蛋白质结构功能新酶分子蓝图新酶分子蓝图 选择性修饰方案选择性修饰方案突变酶突变酶 新酶新酶克隆酶克隆酶产品产品效用效用发发展展酶基因酶基因遗传设计遗传设计遗传修饰遗传修饰DNA重组技术重组技术DNA重组技术重组技术生物酶工程示意图Back人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。