荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸实验.pdf

仪器分析实验报告—实验五 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸 1 实验实验五五 荧光分析法测定邻荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸羟基苯甲酸 学号学号36010712 姓名姓名 张中豪 实验日期实验日期 2009 年年 3 月月 16 日日 第第 一一 组组 同组姓名同组姓名 张雪、张琳琳、傅磊、洪延 1. 学习荧光分析法的基本原理和操作； 教师评定教师评定 . 【【实验目的实验目的】】 2. 用荧光分析法进行多组分含量的测定 【【实验实验原理原理】】 1 1、、荧光分析法原理荧光分析法原理：： 当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激发态中各种振动状态的一种然而由于分子通过与溶剂分子、同类分子或其他分子的碰撞，而失去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此过程中并不发光但当分子从激发态的最低振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级跃迁至基态的各个不同的振动能级时，则以光的形式辐射出能量，所辐射出的光既是荧光。

荧光物质的荧光强度与其浓度、分子结构和化学环境（如体系的 pH、温度）有关而且与体系所吸收的激发光强度成正比，则： 0()FII= Φ− 式中，F 为荧光强度；0I为入射光的强度；I为通过厚度为 b的介质后的光强度；Φ为量子效率，为发射的光子与吸收的光子之比又比尔定律可得： 0(1 10)bcFIε−= Φ− 式中，ε为荧光分子的摩尔吸光系数；b为液槽的厚度；c为荧光物质的浓度对于很稀的溶液，投射到样品溶液上被吸收的激发光不到 2%时，即bcε<0.05 时，则上式可近似写为： 02.303FIbcε=Φ 仪器分析实验报告—实验五 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸 2 当入射光强度一定时，实验条件一定时，则 ： FKc= 即在低浓度时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系，这就是荧光定量分析的基础荧光强度和溶液浓度呈线性关系只限于极稀的溶液，对于较浓的溶液，其吸光度超过 0.05 时荧光强度与浓度的线性关系将发生偏离 2 2、激发光谱和发射光谱：、激发光谱和发射光谱： （（1 1）激发光谱：）激发光谱： 荧光是光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，这可以从它们的激发光谱曲线来确定。

绘制激发光谱曲线时，选择荧光的最大发射波长为测量波长，改变激发光的波长，测量荧光强度的变化以激发波长为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，即得到荧光化合物的激发光谱激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收关顾不仅形状相同，而且波长位置也一样这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程 （（2 2）发射光谱：）发射光谱： 发射光谱简称荧光光谱如果将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度，即得到荧光光谱 3 3、试验方法机理：、试验方法机理： 邻-羟基苯甲酸（亦称水杨酸）和间-羟基苯甲酸分子组成相同，均含一个能发射荧光的苯环，但因其取代基的位置不同而具有不同的荧光性质在 pH=12 的碱性溶液中，二者在 310nm 附近紫外光的激发下均会发射荧光；在 pH=5.5 的近中性溶液中，间-羟基苯甲酸不发荧光，邻-羟基苯甲酸因分子内形成氢键增加分子刚性而有较强荧光，且其荧光强度与 pH=12 时相同利用此性质，可在 pH=5.5 时测定二者混合物中邻-羟基苯甲酸含量时，间-羟基苯甲酸不干扰另取同样量混合物溶液，测定 pH=12 时的荧光强度，减去 pH=5.5 时测得的邻-羟基苯甲酸的荧光强度，即可求出间-羟基苯甲酸的含量。

已有研究表明，二者的浓度在 0～12/g mLµ范围内均与其荧光强度呈良好的线性关系， 且对-羟基苯甲酸在上述条件下均不会发射荧光，不会干扰测定，故而亦可在邻-羟基苯甲酸、间-羟基苯甲酸、对-羟基苯甲酸三者共存时，用上述方法测定出邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸的含量 【【主要仪器和试剂主要仪器和试剂】】 1 1、、 仪器：仪器：岛津 RF-5301PC 型荧光分光光度计，其基本操作参见附录10mL 比色管、分度吸量管 仪器分析实验报告—实验五 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸 3 2 2、、 试剂：试剂： 邻-羟基苯甲酸标准溶液：60/g mLµ(水溶液)；间-羟基苯甲酸标准溶液：60/g mLµ（水溶液） ； HAc-NaAc 缓冲溶液：47gNaAc 和 6g 冰醋酸溶于水并稀释至 1L，得 pH=5.5 的缓冲溶液； NaOH 水溶液；0.1mol/L 【【实验步骤实验步骤】】 1 1、、 配制标准系列和未知溶液配制标准系列和未知溶液：： （1） 分别移取 0.40、0.80、1.20、1.60 和 2.00 邻-羟基苯甲酸标准溶液于已知编号的 10mL 比色管中，各加入 1.0mLpH5.5 的 HAc-NaAc 缓冲液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。

则各份邻-羟基苯甲酸的标准系列液浓度如下： 浓度（μg/mL） 2.4 4.8 7.2 9.6 12 （2） 分别移取 0.40、0.80、1.20、1.60 和 2.00 间-羟基苯甲酸标准溶液于已编号的 10mL 比色管中，各加入 1.2mL 0.1mol/L 的 NaOH 水溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用 则各份间-羟基苯甲酸的标准系列液浓度如下： 浓度（μg/mL） 2.4 4.8 7.2 9.6 12 （3） 取未知溶液各 2.0mL 于 10mL 比色管中，其中一份加入 1.0mL pH5.5 的 HAc-NaAc 缓冲液，另一份加入 1.2mL 0.1mol/L 的 NaOH 水溶液，均用去离子水稀释至刻度，摇匀备用 2 2、、 测定荧光激发光谱和发射光谱：测定荧光激发光谱和发射光谱： 测定（1）中第三份溶液和（2）中第三份溶液各自的激发光谱和发射光谱先固定发射波长为 400nm，在 250～350nm 区间进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长max exλ为 303.0nm；再固定激发波长max exλ=303.0nm，在 350～500nm 区间进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长max emλ403.5nm。

此时，在光谱中发现在激发光谱max exλ=303.0nm处和发射光谱max emλ=403.5nm 处的荧光强度基本相同 3 3、、 荧光强度的荧光强度的测定：测定： 根据上述激发光谱和发射光谱扫描结果，确定一组波长（max emλ=303.0nm 和max exλ=403.5nm） ，使之对仪器分析实验报告—实验五 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸 4 二组分都有较高的灵敏度，并在此组波长下测定前述标准系列各溶液和未知溶液的荧光强度fI 【【实验数据及实验数据及结果结果】】 （计算机输出数据见附表）（计算机输出数据见附表） 1、、 标准工作曲线的制作：标准工作曲线的制作： 该实验的定量测定进行了两组并行对照实验，以各标准溶液的fI为纵坐标，分别以邻-羟基苯甲酸或间-羟基苯甲酸的浓度为横坐标通过计算机拟合制作工作曲线 得到了四组工作曲线， 分别对应四分数据图并由一元线性回归的相关系数计算公式：,(, )x y xyCov X Yρσ σ=得个工作曲线的相关系数，其数据如下： 浓度/μg/mLIfIf平均浓度/μg/mLIfIf平均 24.70721.878 24.53621.922 24.84121.912 48.98245.595 49.02145.844 48.67745.848 64.75566.524 65.14966.784 65.07466.149 85.8383.743 86.18183.918 86.42983.903 101.21797.896 101.03398.102 100.91297.628相关系数相关系数21.90445.76266.48683.85597.8752.44.87.29.6120.994794525101.054If=0.126m-1.032(m为浓度)第一组 间-羟基苯甲酸2.44.87.29.61224.69548.89364.99386.1470.996971825第一组 邻-羟基苯甲酸If=0.126m-0.778(m为浓度)浓度/μg/mLIfIf平均浓度/μg/mLIfIf平均 24.6920.887 24.66520.727 24.63420.836 46.25943.211 46.32943.411 46.46843.356 66.76161.094 66.29361.12 66.70261.338第二组 间-羟基苯甲酸第二组 邻-羟基苯甲酸2.44.87.224.66346.35266.585332.44.87.220.8166743.32661.184仪器分析实验报告—实验五 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸 5 85.32682.699 85.29182.813 85.07182.827 102.07595.17 101.604 95.396 102.010 95.205相关系数相关系数0.99614839.6 82.7796795.25712If=0.127m-0.531(m为浓度)9.612If=0.124m-0.881(m为浓度) 0.99874985.22933101.9862 2、、 未知溶液中间未知溶液中间- -羟基苯甲酸和邻羟基苯甲酸和邻- -羟基苯甲酸浓度的确定：羟基苯甲酸浓度的确定： 通过荧光分光光度计测量并向计算机输入数据，计算机从标准工作曲线上读取数据得到各未知溶液在pH=5.5(含HAc-NaAc缓冲溶液)时的荧光强度和pH=12(含NaOH缓冲液)时的荧光强度并确定与荧光强度相对应的待测物的浓度。

通过pH=5.5 时的荧光强度可以定量确定邻-羟基苯甲酸的浓度c邻，通过pH=12 时的荧光强度可以定量确定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸的总浓度c总c总-c邻即得间-羟基苯甲酸的浓度c间未知溶液 1（pH=5.5测邻-羟基苯甲酸在待测液中的浓度） 数据如下： 第一组： 荧光强度（Int） 43.635 43.696 43．681 平均荧光强度（Int） 43.671 浓 度（Conc）/g mLµ 4.7321 4.7398 4.7379 平均浓度（Conc）/g mLµ 4.7366 未知溶液 1（pH=12 测间-羟基苯甲酸在待测液中的浓度） 总荧光强度 90.478 90.738 89.734 总平均荧光强度 90.317 邻—羟基苯甲酸的荧光强度 43.671 间—羟基苯甲酸的荧光强度 46.646 间—羟基苯甲酸的浓度 4.8454/g mLµ 由于待测液是由未知液稀释 5 倍得到的，故可由求得的浓度得到未知液浓度,如下表： 未知溶液 1 邻-羟基苯甲酸的浓度/g mLµ 23.683 间-羟基苯甲酸的浓度/g mLµ 24.227 仪器分析实验报告—实验五 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸 6 第二组： 未知溶液 2（pH=5.5测邻-羟基苯甲酸在待测液中的浓度） 荧光强度（Int） 46.959 46.957 46.956 平均荧光强度（Int） 46.957 浓 度（Conc）/g mLµ 5.4524 5．4522 5.452 平均浓度（Conc）/g mLµ 5.4522 未知溶液 2（pH=12 测间-羟基苯甲酸在待测液中的浓度） 总荧光强度 93.747 94.691 93.621 总平均荧。