利用新一代测序检测游离dna低频突变的分析方法.pdf

利用新一代测序检测游离DNA 低频突变的分析方法应用说明Oncomine Lung cfDNA检测试剂盒和Ion S5 XL系统关键成果• 在血液样本中对游离DNA (cfDNA)进行靶向新一代测序 (NGS)分析• 使用 Ion Torrent™ Oncomine™ Lung cfDNA检测试剂盒 可检测单核苷酸变异(SNV)热点以及插入或缺失突变(Indel突 变)，检测下限可达0.1%等位基因突变频率• 灵活的1至50 ng起始DNA量，可以检测更多样本• 研究肿瘤异质性并找出主要肿瘤驱动突变和耐药突变， 在非小细胞肺癌(NSCLC)样本中靶向测序11个基因内的 超过150个SNV热点• 使用创新的标签测序技术和Ion Torrent Oncomine Knowledgebase Reporter，结合临床研究中的样本特异 性突变，只需2天即可完成从血液样本到详细突变数据 的完整工作流程，轻松获得关键信息介绍先进的NGS分子分析方法使的临床研究者可以从感兴趣的血液样本获得精细基因突变这些方法有望在将来影响癌症的初始诊断、治疗监控和复发监控癌症研究者知道每个肿瘤都是不同的虽然组织样本检测仍是标准操作，但是液体活检样本有下列优点：a)允许从同一病人获取不同时间点的多个样本进行系列分析；b)可以更好的研究肿瘤异质性；c)在组织样本无法提取的情况下仍可采样研究；d)相比采集组织样本介入性更小成本更低。

在通常样本中ctDNA含量很低，代表着低含量的突变DNA (0.1–1.0%)为了充分利用液体活检样本，转化医学和临床研究者需要一种能进行多生物标记分析的NGS检测方法以找到低频率的主要肿瘤驱动突变和耐药突变该应用笔记描述了从单个血液样本分离cfDNA并使用Oncomine Lung cfDNA检测试剂盒进行突变分析的工作流程，该工作流程在Ion S5™ XL系统上进行，并使用Torrent Suite™5.2或更高版本软件的突变检出插件进行分析方法游离DNA提取要从10 mL血液样本分离cfDNA，首先离心样本以分离血浆部分然后使用Applied Biosystems™ MagMAX™ Cell-Free DNA提取试剂盒根据使用手册步骤从血浆提取cfD-NA此实验从健康捐献者样本获得了5-20 ng cfDNA，从晚期肺癌病人样本获得了5-100 ng cfDNA文库和模板制备根据Oncomine Lung cfDNA检测试剂盒使用指南中的标准文库构建方法扩增纯化的cfDNA使用Ion Torrent Tag Se-quencing Barcode Set 1–24对文库进行条码序列标记。

根据标准实验方案在Ion Chef™系统内混合8个文库并在Ion S5 XL系统上的Ion 530™ Chip上进行测序该分析使用可处理多达8样本的Ion 530 Chip芯片进行也可选择在Ion PGM™系统和 Ion Proton™系统上进行，分别使用Ion OneTouch™ 2和Ion Chef系统进行模板制备技术由于ctDNA含量很低，因此该检测中使用了一种创新的标签测序技术该技术将独特的分子标签(UMT)标记到基因特异性引物上UMT使得cfDNA突变检出插件能够将测序读值归类为不同的扩增家族，从而以高置信度检出频率低达0.1%的体细胞突变并去除文库构建和测序过程中引入的随机误差Oncomine Lung cfDNA检测试剂盒的检测下限为突变频率0.1%，灵敏度>90%且特异性>98%，或者说可检出1,000个野生型(WT)背景拷贝内的1个突变拷贝为达到0.1%的检测下限(LOD)，需要使用20 ng的起始DNA可以使用更少量的起始DNA，但是检测下限将随着起始量减少而升高(图2)图2. Oncomine Lung cfDNA检测试剂盒测序及检测下限(LOD)为 0.05%至1%时对应的起始DNA量要求。

图1. 完整的Oncomine cfDNA检测工作流程Oncomine Knowledgebase Reporter可在Ion Reporter 5.2或更高版本的软件中使用表1： FFPE样本和cfDNA的突变性1样本突变FFPE样本cfDNA1EGFR-L858R71.42%2.62%2TP53-R158L51.89%4.32%3MET-T1010I43.87%51.75%KRAS-G12C34.62%0.28%4NA未检测到未检测到5EGFR-L858R58.44%7.28%MET-T1010I41.93%48.72%TP53-Y220C35.54%1.93%6TP53-R158L10.19%1.26%1 体细胞突变—生殖系突变表2. 基因工程对照样本在突变频率0.1%和0.5%时的检测灵敏度0.1% frequency10.5% frequency2平均灵敏度90%100%平均特异性98%98%1 检测了片段化的基因工程癌症热点对照样本， 频率0.1% 2 检测了片段化的基因工程癌症热点对照样本， 频率0.5%表3. 从Multiplex cfDNA Reference Standard Set标准参考样本中检出的突变。

样品EGFR E746_A750delELRAEGFR L85REGFR T79MEGFR V769_D770insAVKRAS G1DNRAS A59TNRAS Q61KPIK3CA E545K0.1% HDX10.060.170.060.100.220.170.150.101% HDX20.721.070.750.741.141.151.152.295% HDX34.524.866.323.976.346.116.945.29100% WT40.000.000.000.000.000.000.000.001 对于频率0.1%的数据， 此处显示的数据来自使用50 ng Horizon Discovery 0.1% LOD对照样本构建的文库 2 对于频率1%的数据， 此处显示的数据来自使用10 ng Horizon Discovery 1.0% LOD对照样本构建的文库 3 对于频率5%的数据， 此处显示的数据来自使用5 ng Horizon Discovery 5% LOD对照样本构建的文库 4 100% WT数据是来自Multiplex cfDNA Reference Standard Set标准参考样本的阴性对照样本。

此处使用数据来自20 ng的100% WT对照样本构建的文库 使用100% WT对照时未出现假阳性分析测序数据使用Torrent Suite5.2或更高版本的软件中的cfDNA突变检出插件进行，通过优化参数和应用标签测序技术，该软件去除了通常在文库构建和测序过程中产生的很多随机误差结果Oncomine Lung cfDNA检测试剂盒靶向NSCLC中的关键基因：ALK, BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS, MAP2K1, MET, NRAS, PIK3CA, ROS1和TP53使用匹配的晚期NSCLC组织和血液样本，可观察到FFPE样本和血浆cfDNA样本中检出的突变体之间存在高度相关性(表1)在FFPE肿瘤样本中检测到比血浆样本中更高的癌细胞突变等位基因，这一点符合预期同样的，在两个病例中，MET-T1010I基因的生殖系突变体在FFPE和血浆样本中频率均接近50%，也符合预期Oncomine Lung cfDNA检测试剂盒的平均灵敏度达90%，平均特异性大98%，检测下限(LOD)达0.1%，这使其可以分析难检测的研究样本(表2)除了在对照样本中检测到预期的突变之外，所检测的实际cfDNA样本在超过8个文库中检出低频cfDNA突变表现出较高特异性。

为验证该工作流程的性能，我们使用来自Horizon Discovery™的基因工程对照样本作为起始DNA进行Oncomine Lung cfDNA文库构建表3的数据显示使用Oncomine Lung cfDNA检测试剂盒分析Horizon Discovery™ Multiplex cfDNA Reference Standard Set标准参考样本时，突变检出插件检测到全部8个体细胞基因工程突变的频率订购信息产品货号Oncomine Lung cfDNA AssayA31149Tag Sequencing BC Set 1-24A31830MagMAX cfDNA Isolation KitA29319Ion Chef Instrument4484177Ion 520 and Ion 530 Kit-Chef A30010Ion 530 Chip KitA27764Ion S5 XL SystemA27214结论Oncomine Lung cfDNA检测试剂盒检测内容包含35个扩增子，覆盖11个基因内的>150个SNV热点与Ion S5系统结合使用时，该检测方法可以对血液cfDNA进行有效的多生物标记分析。

该方法检测下限低至 0.1%并具有高特异性和灵敏度，临床癌症研究者可使用它更快检测到ctDNA，从而可以在耐药突变出现时更好的对其进行研究更多信息请见 。