hplc(液相色谱)常识及疑难详解(附实际操作图解).doc

1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子 k 达到良好的分离目的Detection wavelength：检测波长，retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线一般应平行于时间轴Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height：半峰高宽Peak Area：峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象.1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。

常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如 C18、C8 ）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间适用于分离非极性和极性较弱的化合物，极性大的组分先出柱（现在大部分液相用的是反相色谱法）1.2.2 流动相注意事项1.2.2.1 pH 值的选择C18 和 C8 使用的流动相 pH 值通常为 2.5~7.5（2~8），太高的pH 值会使硅胶溶解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落1.2.2.2 滤膜的使用对于盐类等试剂，或者没有色谱纯的试剂，可以使用分析纯的，但是在使用前需要用 0.45um 或 0.22um 的滤膜过滤盐类试剂最好现配现用使用滤膜时应注意：有机膜能滤水系，水系膜不能滤有机如果流动相是有机溶剂的比例，那么就应该用有机膜过滤（但是如果是梯度进流动相的话，盐溶液可先单独用水膜过滤）水膜：纤维素微孔滤膜，易溶于丙酮等中等极性有机溶剂，不易燃烧，可用于空气测定之用，亦可用于乙醇或水液体过滤纤维素膜:a) 醋酸纤维素膜：可过滤低分子量的醇类、水溶液、酒类、油类。

b) 硝酸纤维素膜：适用于水溶液、空气、油类、酒类过滤不耐酸碱，溶于有机溶剂可进行热压灭菌c) 醋酸纤维与硝酸纤维素混合酯膜：性质类硝酸纤维素膜但可适用于 PH 值 3～10 范围，10％～20％的乙醇，50％的甘油，30％～50％的丙二醇等，而 2％聚山梨酯 80 对膜有显著影响微孔滤膜使用前，应进行清洗处理，用蒸馏水浸泡洗净后装于滤器内，有机溶剂的过滤则用乙醇浸泡清洗色谱样品或试剂的过滤，若是水系的，蒸馏水洗净浸泡后，再蒸馏水预过滤，若有机系过滤，最好先将本品在纯甲苯和 95%以上的乙醇中分别浸泡过夜，再纯甲苯和纯乙醇预过滤，彻底洗净膜后使用 微孔滤膜正反：a) 各向同性，不分正反面，对额定孔径以上固体微粒能起到绝对截留的作用b) 有正反面，亮光强的为反面，亮光弱的为正面，膜内孔径从正面到反面逐渐递减使用时应将正面对着待滤液，即待滤液从亮光弱的一面流入，滤净液从亮光强的一面流出，欲截留微粒相当于经历了孔径从大到小多层滤膜的阻截而不易堵塞，可显著延长使用寿命使用时应在膜处理前认好正反面，（光线从侧面照膜可以比较出），作上记号，入水后正面将难以分辨有机膜尼龙（聚酰胺）微孔滤膜材料为脂肪族尼龙，有良好的亲水性，耐适当浓度的酸碱，不仅适用于含有酸碱性的水溶液，亦适用于含有机溶剂，例醇类、烃类、醚类、酯类、酮类，苯和苯的同系物，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜等等，是适用范围最广的微滤膜之一。

有机膜入水后显著变脆，入有机溶剂强度的减少则轻些有机能滤水系，水系不能滤有机1.2.2.3 有机相的选择使用反相色谱柱可以有三种有机溶剂可以选择，甲醇、乙腈和四氢呋喃每一种溶剂都有其独特的优点，需根据具体情况选择有些样品的紫外吸收很弱，所以分析时紫外检测器的波长为220nm 甚至更低，但是四氢呋喃的紫外吸收比较强，所以在波长低于 240nm 时，就不能选择这种溶剂尽管低浓度的甲醇在较低的波长下也可使用，但是在低于 220nm 时，甲醇的浓度不易控制选择何种溶剂还必须考虑其与样品及空气之间不发生作用，而四氢呋喃易分解，形成过氧化物，所以使用这种溶剂时须格外小心一些研究人员发现，在四氢呋喃中加入水可以解决这个问题，但它与色谱柱平衡所需的时间比甲醇、乙腈长，而且其不愉快的气味也是一个不利因素与四氢呋喃相比，甲醇和乙腈的最大优点是在柱压较低的条件下，流速可控制在 1-2ml/min 之间考虑到理想溶剂的特点，如粘度低、紫外吸收弱、与样品不相互作用，而且使用方便，所以首选的有机溶剂应是乙腈，当然利用甲醇作为有机溶剂的也较为常见1.2.2.4 水相的选择样品为一般化合物，可以用水作为水相，然而离子化合物在药物分析时普遍存在，而这类化合物需要控制 PH 值才能得到很好的分离。

如流动相的 PH 值必须高于或低于样品的 PKA1.5 个单位在分析有机酸时，当 PH 值低于 3 时，色谱柱一般还比较稳定，然而当 PH 值高于 8 时，就需要缓冲液，因为此 PH 值已经超出了二氧化硅的有效使用范围宽 PH 值的二氧化硅柱也比较常见，但是对高PH 值物质的分离，很少有这方面的报道所以建议使用缓冲液来减少二氧化硅的流失考虑到样品的特性及柱子的稳定，建议在分析 PH 值较高的物质时应使用缓冲液，2.5mM 的磷酸盐缓冲液 (PH=2.5)是非常合适的水相如果在分析方法中使用了分光仪，那么就必须选易挥发的缓冲液，尽管不如真正的缓冲液有用，但 0.1% Trifluoroacetic 酸和乙酸能够满足 PH 值的控制要求1.3 色谱柱现在大部分液相色谱分析都是使用反相液相色谱柱，其中以C18 和 C8 柱最为流行这两种色谱柱之所以运用广泛是因为在大多数情况下，使用这两种柱子都能获得理想的分离效果尽管一些样品的分离并不是这两种柱子，但 C18 和 C8 经常是最好的固定相，C18 和 C8 柱两者之间并无明显的差别，但在我们实验室中以常使用的是 C18 柱1.3.1 柱子尺寸规格的选择液相色谱分析时柱子选择的另一个因素就是柱子大小、及填充颗粒的直径(dp)的选择。

最常用颗粒直径为 5μm，但颗粒的直径(dp)为 3.0 及 3.5μm的也适合分析使用，但大多数色谱工作者都喜欢使用颗粒直径为 5μm的色谱柱，因为这种色谱柱具有很长的使用历吏颗粒的 dp 小意味着可以获得较高的理论塔板数，但所需的柱压增大，而且 dp 为 3.0μm的色谱柱易堵塞，所以一些色谱制造商又生产出dp 为 3.5μm的色谱柱我们实验室使用的是 4.6mm*250mm,dp 为 5μm，伊利特hypeisil ODS2 的色谱柱，硅胶基质上键合了 C18 为官能团的色谱柱填料，是典型的高效液相色谱柱用填料，适合于分析非极性和中性样品，包括酸性、中性及亲脂性化合物1.4 其他因素选择液相色谱的分析方法时，必须考虑到其它的一些因素，比如温度因为温度变化 1 度，保留时间将变化 1-3%，所以温度控制十分重要，温度的变化还影响色谱柱的选择性在分析时柱温一般比室温高一点( 如 35℃)，因为此温易控制，而且在低压下有利于降低溶剂的粘度，从而降低柱压2 实际操作这里简单介绍一下重点实验室岛津 LC20-AT 液相色谱仪及其相关操作2.1 溶剂准备：色谱纯级别a) 过滤—0.45μm 滤膜（纤维素膜水溶液， 尼龙、PTFE 通用型）。

b) 脱气—超声 5-10min，排除 O2，N2 等保证流量准确，提高色谱图重现性，增加信噪比（低紫外去氧气吸收），保护色谱柱（填料氧化）c) 溶剂截止波长：最好避免，如乙腈和水 190nm, 甲醇和乙醇210nm,等d) 缓冲盐流动相：需现配现用，低温密封保存最多 3 天；有机溶剂和缓冲盐（水）混配流动相，需低温保存e) 溶剂混溶性：建议用色谱纯 10%异丙醇 or 水作为过渡溶剂Notice：流动相--最多可以做 A,B,C,D 四通道梯度混合洗脱；灌注柱塞密封清洗液（seal wash ）--一般建议使用 6-10%甲醇水溶液；针头清洗液（needle wash 绿色）--一般选择 80%甲醇和 20%水玻璃容器必须使用超纯水清洗； 所有溶剂和溶液在使用前必须用 0.45μ m 的滤膜过滤，并至少超声脱气 5 分钟； 用洁净的玻璃容器盛放溶液和流动相，避免污染； 2.2 操作步骤2.2.1 开机和平衡系统 1 接通电源，依次开启稳压电源、A 泵、B 泵、柱温箱、自动进样器、检测器、系统控制器，待自检通过2. 打开计算机电源3. 排空操作：打开 LC-20AT 泵排空阀（逆时针 90 度以上），按Purge 键，泵开始排空运行。

三分钟自动停止）然后关紧排空阀（顺时针旋紧）或者开机之前，直接打开排空阀，听到滴声之后，关紧排空阀4.把吸滤头放入流动相瓶中，打开排液阀，按 purge 键排液 2～3 分钟，purge 完毕后关闭排液阀启动泵送液（流速开始不宜太高应为正常分析流速的 50％～80％），此时可以同时进行自动进样器的purge 操作（时间为 15～25 分钟）自动进样器清洗液一般使用与流动相比例接近的不含缓冲盐的试剂也可以用甲醇：水＝70：30 或甲醇：水＝1：1 代替，观察检测器基线平稳后即可做样注意：a.如果使用前色谱柱中保存的流动相为纯甲醇或纯乙腈，而新流动相中含有缓冲盐时，应先用纯水冲洗色谱柱十分钟左右再使用流动相，以免盐析出损坏系统b.如系统为正相和反相交换使用，应先将所有管路用异丙醇清洗后再更换新流动相使用）2.2.2 数据采集及分析1 在桌面上双击 labsolution 图标进入实时分析窗口在开机画面中，User ID 选中 Admin，不需输入 Password，点击 OK2 在左侧助手栏给出了引导顺序操作的图标3 点击 Data acquisition 进入采集数据编辑方法界面选中Normal（通用简单）或 Advanced（高级详细）项a) 设定 Pumps 泵参数（⊙Pumps 泵参数：Mode 控制方式，Flow流速，B，C ，D conc 各项浓度，P Max 最大压力 ）b) Oven 柱箱参数(Oven 柱箱参数：Oven 设定温度，T Max 最大保护温度 ) c) Detecter 检测器参数： Cell 设定池温。

Wavelength 设定波长d) Controller 系统控制器参数：e) Data acquisition 选中 Acquisition Time 后，设置分析时间，等等 f) LC Time Prog 时间程序参数：编辑泵梯度洗脱程序，也可以控制柱箱，检测器，等等g) 点击 Method∈Data Analysis Parameter 编辑积分。